玉米种子萌发过程内部水分流动规律的低场核磁共振检测

宋 平，彭宇飞，王桂红，宋 鹏，王开田，杨 涛※

（1. 沈阳农业大学信息与电气工程学院，沈阳 110866；2. 北京农业信息技术研究中心，北京 100097；3. 国家农业智能装备工程技术研究中心，北京 100097）

0 引 言

玉米是中国主要的粮食作物、饲料作物和经济作物，玉米种子的萌发情况在其繁衍和丰产方面具有重要的意义[1-4]。水分是玉米种子萌发不可或缺的必要条件，研究玉米种子萌发过程中种子内部水分的流动规律，观察水分的动态运移过程，分析其内部生理代谢状态，对于确定种子的发芽力具有重要的指导意义。传统的研究方法一般是基于数量统计的发芽率研究，或者从时间角度考量水分变化情况，亦或通过对种子生理解剖来解释其内部水分的分布情况。前者不能直接研究种子内部的水分分布及动态流动规律，后者作为一种破坏性的检测方法无法持续监测同一粒种子的水分变化过程，所以寻求一种快速、准确的检测方式对玉米种子的萌发过程进行监测具有重要的意义。

低场核磁共振技术以其非侵入及无损伤的优势，能够直观检测对象的内部结构特征和水分分布情况，可以活体监测作物的生理生化过程，近年在食品农业领域展开了广泛的应用[5-13]。牟红梅等[14]利用横向弛豫时间反演谱并结合质子密度加权像，对小麦灌浆过程籽粒的水分变化规律进行了核磁共振活体检测研究。王淼等[15]利用低场核磁共振技术对柑橘汁胞粒化程度实现了人工智能的鉴定和识别。杨文鸽等[16]利用低场核磁共振研究了盐溶液的漂洗对带鱼鱼糜凝胶水分分布和凝胶特性的影响。国际上农业领域专家也利用无损检测技术对作物的萌发过程展开了诸多研究[17-27]，然而利用低场核磁共振技术对玉米种子萌发过程进行研究尚未见相关报道。

本试验利用低场核磁共振技术对玉米种子的胚从静止休眠状态恢复至生理活跃状态的萌发过程进行监测。通过连续60 h对玉米种子的吸胀、萌动和发芽3个阶段的萌发过程进行观测，分析种子内部的水分含量变化典型时刻的水分分布状况，测定不同萌发温度对种子吸水及萌发情况的影响，对深入了解种子萌发过程的物质转化，确定后期的生长发育及品质形成情况，及生产实践具有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验设备

MiniMR-60 核磁共振仪（磁体类型：永磁体，磁场强度：（0.5±0.05）T，射频脉冲频率：12.2 MHz，磁体温度：32 ℃，探头线圈直径：15 mm，上海纽迈电子科技有限公司）；MGC-1500HP-2人工气候箱（控温范围：有光照10～50 ℃，光照强度：0～40000 LX，光照方式：隔板式，上海一恒科学仪器有限公司）；Mettler-Toledo XS105 DualRange分析天平（最大称量：120 g，梅特勒上海沪司实验仪器有限公司）；另玻璃试管、刻度滴管、培养盒、发芽纸若干。

1.2 试验材料

研究材料采用沈阳农业大学农学院的2016年玉米种子，本试验力求对生产实践提供帮助，故试验玉米种子经过包衣处理，品种分别为农大108号、辽单565号、郁青一号，各品种玉米种子的主要化学成分如表1所示。

表1 玉米种子的主要化学成分Table 1 Main chemical constituents of corn seeds

1.3 试验方法

1.3.1 样本制备

将 3个品种挑选外观一致、大小均匀、成熟饱满的玉米种子各160粒，每4粒为1组，每个品种制作40组平行的试验样本。为降低样本间初始含水量差异对试验结果的影响，对全部试验样本进行称质量处理，试验选取的每个样本质量均为1.685 g，试验样本的初始质量含水率为13%左右。

1.3.2 核磁共振波谱试验

首先利用标准油样通过FID（free induction decay）脉冲试验，寻找核磁共振的中心频率及脉冲宽度，根据前期试验结果及预试验效果[28-30]，本试验设置的参数值为：射频信号频率主值SF1=12 MHz，射频90°脉冲脉宽P1=7.6 μs，射频 180°脉冲脉宽 P2=11.8 μs。

将3个品种各40组试验样本的玉米种子分别垂直装入玻璃试管的底端，并将玻璃试管水平插入至低场核磁共振仪中心位置，利用 CPMG（carr-purcell-meiboomgillsequence）脉冲序列进行核磁共振信号采集，获取萌发时间为0 h的试验数据，每组试验样本4次重复。CPMG脉冲序列的主要参数设置如下：采样点数 TD=161424，累加采样次数NS=64，射频信号频率偏移量O1每次设置略有不同。

1.3.3 玉米种子萌发试验

首先用质量分数为 3%的次氯酸钠擦拭所有玉米种子的表面，对试验样本进行消毒处理，再利用蒸馏水冲洗 3次。然后将试验样本均匀放置在垫有单层滤纸的培养盒中，每个培养盒放 1组玉米种子。用刻度滴管将等量的蒸馏水直接滴在种子表面，以便种子充分吸水，加水完毕后在种子上面再覆盖一层滤纸，并将发芽盒做密闭处理，以防水分散失。将3个品种的各20组试验样放在温度为 25 ℃恒温环境的人工气候箱中，剩余的各 20组试验样放在温度为31 ℃恒温环境的人工气候箱中，同时进行萌发培养，均保证发芽盒内水分充足，并设定气候箱光照充足。

分别于12 h（吸胀阶段的典型时刻）、36 h（萌动阶段的典型时刻）、60 h（发芽阶段的典型时刻）取出玉米种子[1]，用滤纸擦干种子表面水分，再利用低场核磁共振对试验样本进行跟踪测量，采集此时刻试验样本的核磁共振信号数据，将采集过的试验样本补充水分后重新置于人工气候箱继续培养，实现对玉米种子萌发过程的监测。

1.3.4 核磁共振波谱反演试验

将核磁共振波谱分析软件采集到的 4次重复数据导入SPSS软件中计算获取每个样本的核磁共振数据均值，将均值作为试验样本的核磁信号幅值导入核磁共振反演软件，对试验数据进行反演运算。

根据前期试验结果及预试验效果[28-30]，反演软件主要参数设定如下：分组形式为多分组，反演参数为 T2，开始时间为0.01 ms，截止时间为10 000 ms，参与反演点数为200个，迭代次数为100 000（根据试验样本特点及反演波谱效果设定）。

1.3.5 萌发率测定

将萌发试验样本分别于12、36、60 h从人工气候箱中取出，对试验样本萌发种子数计数（以胚部膨胀破皮为准），计算种子萌发率。

种子萌发率=已萌发种子数/种子总数×100%，本试验过程中3个品种玉米种子总的萌发率情况，如表2所示。

表2 3个品种玉米种子的总体萌发率Table 2 Overall germinating rate of 3 varieties corn seeds

1.4 数据处理

将核磁共振反演软件导出的所有数据交由 SPSS软件进行分析处理，所有数据均以均值±标准差形式表示。

2 结果与分析

2.1 玉米种子萌发过程内部水分相态的划分

图1为随机选择3个品种萌发时间为0 h的任意2个试验样本的核磁共振反演谱信号数据，横坐标为横向弛豫时间，纵坐标为核磁共振信号幅值。

图1 玉米种子横向弛豫时间反演谱Fig.1 Inversion spectrum of transverse relaxation time of corn seeds

根据低场核磁共振原理得知，通过T2反演谱呈现的多组分特征可以较为准确地区分样品内部水分相态，根据水分含量与核磁共振T2反演谱信号幅值成正比可以计算被检测物质的水分含量[28-30]。通过对玉米种子萌发过程连续60 h水分分布状况的动态监测发现，无论处于萌发的任何时期，每组试验样本的T2反演谱均有3个波峰，观察发现，每个反演谱的横向弛豫时间T2在10与100 ms处具有明显的分界限。

根据低场核磁共振原理得知，横向弛豫时间的长短可以反应样品内部水分自由度的大小。横向弛豫时间越短说明样品内部水分自由度越低，横向弛豫时间越长说明样品内部水分自由度越高[28-30]。这里，将较短横向弛豫时间T21（0.1～10 ms）部分的水分子定义为结合水，此种水分子与生物大分子结合紧密，动力学活性较小，其信号幅值用A21表示；较长横向弛豫时间T22（10～100 ms）部分的水分子定义为半结合水，此种水分子流动性受一定的制约，其信号幅值用A22表示；最长横向弛豫时间T23（100～1 000 ms）部分的水分子定义为自由水，此种水分子流动性较强，其信号幅值用A23表示；用A表示玉米种子的总水分含量，则A= A21+ A22+ A23。

表3为农大108号玉米种子在25 ℃萌发环境中，萌发时间为0、12、36和60 h的试验数据，通过反演软件得到的峰起始时间、峰顶点时间、峰结束时间以及峰面积统计数据，其他品种统计数据规律相近，这里不再赘述。

2.2 玉米种子萌发过程中各相态水分的流动规律

2.2.1 玉米种子萌发过程中内部结合水的流动规律

图2为玉米种子萌发过程中内部结合水的流动规律，横坐标轴为萌发时间，纵坐标轴为结合水的信号幅值。

表3 水分相态划分横向弛豫时间及信号幅值Table 3 Horizontal relaxation time and signal amplitude for moisture phase division

图2 玉米种子萌发过程中内部结合水的流动规律Fig.2 Flow law of internal combined water during germination of corn seeds

观察图2发现，3个品种玉米种子试验样本在2个萌发环境中结合水含量均表现为先迅速增加后逐渐减小的趋势，增加速度也呈现逐渐减弱现象。成熟的种子在贮藏阶段，各组织比较坚实紧密，细胞内的物质呈干燥的凝胶状态，当种子与水分直接接触，种子将快速吸水膨胀。种子的化学组成主要是亲水胶体，这些亲水胶体快速与外界水分结合，所以萌发初期结合水含量将逐渐增加。当种子吸水达到一定程度，种子活性增强进入到萌动阶段，这个时期种子内部的代谢开始增强，进入到一个新的生理状态，随着种子活性的增强，种子结合水将向半结合水形式转化，水分与大细胞结合能力降低，结合水含量便呈现逐渐降低态势。

2.2.2 玉米种子萌发过程中内部半结合水的流动规律

图 3为玉米种子萌发过程中内部半结合水的流动规律。观察图3发现，3个品种玉米种子试验样本在2个萌发环境中半结合水含量均表现为持续增加态势。种子萌发过程的吸水规律表现为“快-慢-快”的S型，但这种吸水规律在半结合水含量的变化上并没有体现，因为处于萌动阶段的玉米种子虽然整体的吸水量变化微弱，但种子内部的生理活动依旧旺盛，种子内部结合水、自由水同时向半结合水形式转换，此时种子将分解调动足够的营养物质供种子生长。

图3 玉米种子萌发过程中内部半结合水的流动规律Fig.3 Flow law of internal semi combined water during germination of corn seeds

2.2.3 玉米种子萌发过程中内部自由水的流动规律

图4为玉米种子萌发过程中内部自由水的流动规律。观察图4发现，3个品种玉米种子试验样本在2个萌发环境中自由水含量均表现为先减小后急剧增加的趋势，增加速度也呈现逐渐增强现象。自由水是细胞间自由流动的水，负责把营养物质运送到各个细胞，其含量制约着细胞的代谢强度，自由水含量越大生物的代谢越旺盛。试验样本在室温环境放置一段时间，种子的相对湿度平衡水分将因周围环境的相对湿度较大而增加（试验在 8月进行），此时这部分水以游离的形式存在于种子内部并没有参与种子的化学反应，但在总水含量占比很低。萌发初期，自由水参与生物的化学反应，自由水向半结合水形态转变，其含量呈微弱降低态势，随着萌发时间的推移，代谢旺盛的细胞需要大量的自由水参与生物的化学反应，所以自由水含量呈增加态势，而且随着细胞代谢的增强水分的增加趋势也逐渐增强。

2.2.4 玉米种子萌发过程中总体水分的流动规律

图 5为玉米种子萌发过程中总体水分的流动规律。观察图5发现，3个品种玉米种子试验样本在2个萌发化境中，核磁信号总体幅值呈逐渐递增态势，说明试验样本总体水分含量不断增加，但增加速率有所不同。通过传统检测方法得知玉米种子萌发期的吸水率变化存在 3个阶段，第一阶段为快速吸水期，吸水速度迅速增加，第二阶段为平稳吸水期，吸水速度逐渐增大，第三阶段为震荡吸水期，本试验利用低场核磁共振检测与传统试验（烘干称质量方式）结论基本一致，说明低场核磁共振是一种准确的水分检测方式。

图4 玉米种子萌发过程中内部自由水的流动规律Fig.4 Flow law of free water during germination of corn seeds

图5 玉米种子萌发过程中总体水分的流动规律Fig.5 Flow law of total water during germination of corn seeds

2.2.5 玉米种子萌发过程中各相态水分流动情况总体分析

图6为3个品种玉米种子在2种萌发环境中3种水分相态流动的整体情况。

图6中核磁共振信号幅值0为圆心起点，在4个萌发时间以放射线的形式反映出相应的各相态形式水分含量增长情况。分析图6发现，3个品种在2种萌发环境中，从0～60 h的萌发时间中3种水分相态的水分含量均有不同程度的增长，但增长速度不尽相同，这里结合水增长的速度均表现为最高，自由水增长的速度均反映为最低。

在种子萌发的初期，细胞吸水后开始了修复及活化的过程，90%的淀粉水解为葡萄糖，可溶蛋白质直接完全氨基酸化，非可溶性蛋白质部分被水解形成水溶性的较小分子量的蛋白质；脂肪被水解成甘油或氨基酸，在这一阶段，水分子大量参与细胞活化反应，与种子中亲水胶体结合，种子生理活动尚未到达旺盛状态，但种子的生理状态已经较休眠期有了较大的变化。

2.3 萌发温度对玉米种子各相态水分含量的影响

图7为3个品种玉米种子在25℃与31℃的萌发环境的核磁共振信号幅值幅值差异。

图6 玉米种子内部各相态水分的总体变化情况Fig.6 Overall situation of internal phase state water in corn seeds

图7 萌发温度对玉米种子内部各相态水分及总体水分分布的影响Fig.7 Effects of germination temperature on the distribution of internal phase state water and total water in corn seeds

通过观察图7a～7j发现结合水与自由水的变化随萌发温度的改变呈现反复变化的态势，而提高萌发温度玉米种子内部半结合水含量在各个典型时刻均呈现增强态势。提高萌发温度，玉米种子萌发活性增强，水分与生物体内细胞结合能力增强，大量储藏的物质水解后被种胚吸收，种子细胞将吸收大量水分维持自身旺盛的代谢活动。

植物种子的萌发，除了受自身内部的生理条件影响外，还受外部环境的影响，种子发芽吸收的是液态水，当外界温度提高，水分吸收加快。本试验中提高人工气候箱的温度，种子内部酶活性及呼吸作用增强。萌发温度的提高，加剧了细胞的新陈代谢速度，作物的生理活动更加旺盛，果糖、葡萄糖等有机碳水化合物的在酶的催化作用下表现为更强的生命活动状态，种子水分的吸收速率也将随之增强。观察图6发现3个品种的玉米种子的核磁共振信号总幅值均呈增加趋势，与传统方式验证的结果具有一致性。

3 结 论

1）根据横向弛豫谱的多组分特性，通过横向弛豫时间的差异，将玉米种子内部水分划分为 3种水分相态，将横向弛豫时间T21（0.1～10 ms）定义为结合水，此种水分子与生物大分子结合紧密，动力学活性较小，其信号幅值用A21表示；横向弛豫时间T22（10～100 ms）定义为半结合水，此种水分子流动性受一定的制约，其信号幅值用A22表示；横向弛豫时间T23（100～1 000 ms）定义为自由水，此种水分子流动性较强，其信号幅值用A23表示。

2）3个品种玉米种子试验样本在2个萌发环境中，结合水含量均表现为先迅速增加后逐渐减小的趋势，增加速度也呈现逐渐减弱现象；自由水含量均表现为先减小后持续增加的趋势，增加速度也呈现逐渐增强现象；而半结合水和总体水分含量则不断增加，3个品种玉米种子试验样本在萌发期间水分流动规律表现一致。吸胀阶段的快速吸水、萌动阶段的平稳吸水、发芽阶段的震荡吸水的玉米种子萌发过程的低场核磁共振检测与传统烘干减重方式结论一致。

3）各相态水分与萌发温度的变化不具有一致性，但当外界温度提高，种子内部的半结合水和总体水分在萌发过程的各个典型时刻均表现为逐渐增强，说明提高萌发温度，可以促进种子细胞与水分的结合程度，提高总体吸水速度，并提高玉米种子的萌发率。

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