不同剂量雷公藤多苷对小鼠结肠炎模型的作用及机制

张瑜鸿 苗新普

(海南省疾病预防控制中心门诊内科，海南 海口 570203)

溃疡性结肠炎(UC)是结肠黏膜及黏膜下层常见的慢性非特异性炎症反应性疾病，临床患者以腹痛、腹泻、黏液脓血便等为主要表现，具有病程长、易反复、并发症多、预后差等特征。欧美国家UC患病率较高，约为205/10万～240/10万，我国虽为UC的低发国家，但近年来UC的患病率亦呈不断上升趋势〔1，2〕。关于UC的病因及发病机制目前尚未明确阐明，多数学者认为与肠黏膜的免疫反应失衡密切相关〔3〕，近年来Toll样受体(TLR)/核因子(NF)-κB信号通路在各类变应性疾病发生机制中的作用受到广泛关注〔4〕。雷公藤多苷是一类从卫矛科植物雷公藤中提取精制的脂溶性混合物，具有显著的免疫抑制、抗炎、抗肿瘤等功效〔5〕。有研究〔6〕指出，雷公藤多苷对UC小鼠具有显著改善作用，其作用机制可能与TLR/NF-κB信号通路的激活，从而发挥免疫抑制作用有关。本研究通过建立小鼠UC模型，研究不同剂量雷公藤多苷对UC小鼠的作用效果，旨在探讨雷公藤多苷对UC的作用机制，为制定UC的临床治疗方法提供参考依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 选择78只6～8周龄的SPF级BALB/c健康雄性小鼠，体质量18～22 g。均由海南省疾病预防控制中心提供，动物使用许可证：SYXK(琼)2015-0021。以基础饲料适应性喂养1 w，室温(25.0±2.0)℃，湿度55%～70%，自然光照，保持室内通风，避免噪音。

1.2动物模型制备与分组 采用简单随机抽样方法将78只小鼠分为正常对照组(NC组，n=10)、空白对照组(BC组，n=10)及模型组(n=58)。各组小鼠适应性喂养1 w后，NC组与BC组给予常规饲料喂养及自由饮用纯净水，模型组则采用自由饮用质量分数为5%的葡聚糖硫酸钠(DSS，购自美国Sigma-Aldrich公司)溶液以制备小鼠UC模型，持续7 d。每日观察小鼠的粪便形状、精神状况及活动情况，记录其体质量的变化等。造模结束后第2日随机处死模型组小鼠3只，分离腹部结肠组织，以生理盐水冲洗干净后肉眼下观察结肠是否充血水肿，并在显微镜下观察其组织病理学改变。模型组造模成功的依据为：表现为稀便、大便带血(或隐血阳性)或体重减轻的三种症状之一者，且结肠组织呈现一定程度的形态及组织病理学改变。本次成模的小鼠共58只，成功率为100%。后将剩余的55只成模小鼠随机分为模型对照组(MC组，n=10)、雷公藤多苷低剂量组(LD组，n=15)、雷公藤多苷中剂量组(MD组，n=15)和雷公藤多苷高剂量组(HD组，n=15)，其中LD组、MD组和HD组分别灌胃给予剂量为9.01、27.03和81.09 mg·kg-1·d-1的雷公藤多苷片(湖南千金协力药业有限公司，规格：10 mg×50片，批准文号：国药准字Z43020138)混悬液(以蒸馏水配制成0.45、1.35、4.05mg/ml)，而MC组、NC组及BC组均灌胃等量的生理盐水，1次/d，均持续7 d。第22日，除NC组外，均给予其余5组小鼠腹腔注射100 μg脂多糖(LPS)，以激活TLR4/NF-κB信号通路并启动下游炎症因子的释放，24 h后处死小鼠，剖腹剪取结肠组织，摘取肉眼下所见病变最明显处的结肠组织，一部分用于制备组织切片进行病理学观察，另一部分制成组织匀浆，-80℃冻存，待测。

1.3观察指标与方法

1.3.1各组小鼠结肠组织的组织形态学评分 肉眼下观察结肠组织中黏膜层及浆膜层的变化，切取距肛门约8 cm的远端结肠组织，大小约为2.0 cm×2.0 cm，以10%的中性甲醛液固定24 h后行常规石蜡包埋，以切片机制成厚度3～4 μm的连续切片，苏木素-伊红(HE)染色后在光学显微镜下观察各组小鼠的结肠组织病理学表现。参照相关文献〔7〕，对各组小鼠结肠组织的大体形态改变及组织病理学损伤进行评分。

1.3.2各组小鼠结肠组织中TLR4蛋白的表达 采用蛋白质印迹法检测结肠组织匀浆中TLR4的表达水平，主要操作过程包括：取100 mg左右结肠组织，剪碎后加入适量冰磷酸盐缓冲液(PBS)置于匀浆器中进行研磨，滴加蛋白裂解液和PMSF提取组织中的总蛋白。经上样、电泳、转膜后采用甲醇浸泡、缓冲液平衡、转移、脱色等操作，后加入5%的脱脂奶粉进行封闭，4℃过夜后迅速加入一抗(TLR4小鼠单克隆抗体，以封闭液稀释浓度为1∶500，晶美公司)，摇床孵育2 h，4℃过夜、TBS液洗涤4次，各10 min。加入二抗(以封闭液稀释浓度为1∶2 000，晶美公司)，封闭、室温摇床孵育1 h，TBS液洗涤4次，各10 min。加入底物孵育，清除硝酸纤维素膜，以蒸馏水漂洗、晾干，采用Fluor-s凝胶成像系统(环亚生物科技有限公司)分析目的蛋白条带的灰度值，计算其相对含量。

1.3.3各组小鼠结肠组织中NF-κB p65的表达 采用免疫组化EnVision二步法进行检测，主要操作有：将结肠组织切片进行脱蜡、水化、热修复等处理后，滴入1滴3%的H2O2，室温孵育10 min，以阻断内源性过氧化物的活性。PBS冲洗3次，各3 min，晾干，滴加一抗(NF-κB p65兔多克隆抗体，浓度稀释为1∶500，北京博奥森生物公司)，4℃静置孵育1 h后，以PBS洗涤3次，各5 min；滴加山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G-辣根过氧化物酶(HRP)多聚体(稀释倍数为1∶2 000，北京索莱宝科技有限公司)，摇床孵育40 min后，以蒸馏水洗涤3次，各5 min。每张切片滴加1滴新鲜配制的二氨基联苯胺(DAB)液显色3 min，显微镜下观察5 min，流水冲洗终止显色，蒸馏水漂洗后以苏木素复染、0.1%HCl分化、梯度酒精脱水、中性树胶封片。晾干后由2名经验丰富的病理医师采用盲法对切片结果进行判断，评估方法参照相关文献〔8〕，根据阳性细胞(即胞质或胞核呈黄色或棕色的细胞)所占百分比及其染色强度对免疫组化结果进行评分(IHC评分)。IHC评分越高，说明结肠组织中NF-κB p65的表达水平越高。

1.3.4各组小鼠结肠组织中促炎因子的表达 各组小鼠结肠组织中白细胞介素(IL)-1α、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-13的浓度检测方法为酶联免疫吸附法(ELISA)，操作过程主要有：剪取100 mg左右结肠组织，迅速置于液氮中冷却，切成2～3 mm3的小块，在组织匀浆器中加入预冷的50 mmol/L PBS液(pH6.0)进行研磨，在4℃超低温高速离心机中进行离心，14 000 r/min离心10 min，分离上层液体，存于-80℃冰箱中。IL-1α、TNF-α、IL-13的测定严格按照ELISA试剂盒(上海信帆生物科技有限公司)说明书进行。

1.4统计学方法 应用SPSS21.0软件行t检验。

2 结 果

2.1各组小鼠结肠组织的病理学表现及组织形态学评分比较 显微镜下对各组小鼠的结肠组织切片进行观察，可见BC组及NC组结肠组织黏膜光滑、完整，腺体结构清晰，未见水肿、溃疡及炎细胞浸润等炎症反应；MC组结肠组织呈典型的UC病理表现，即黏膜呈明显充血水肿、糜烂、溃疡等表现，溃疡周边腺体结构紊乱且异常增生，黏膜及黏膜下层可见淋巴细胞、浆细胞等炎性细胞浸润；各组雷公藤多苷组小鼠结肠组织炎性改变较MC组呈现不同程度的减轻，LD组发生的炎症反应较MD组及HD组更严重，HD组炎症反应改善状况最明显。各组小鼠形态学评分结果示，各模型组小鼠的大体形态学评分及组织损伤评分均显著高于BC组及NC组，差异有统计学意义(P<0.05)；而BC组与NC组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；各模型组小鼠中，LD组、MD组和HD组的评分均低于MC组，且HD组

2.2各组小鼠结肠组织中TLR4及NF-κB p65蛋白表达水平比较 各模型组小鼠结肠组织中的TLR4含量及NF-κB p65 IHC评分均显著高于BC组和NC组，差异有统计学意义(P<0.05)；而BC组与NC组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；各模型组小鼠中，LD组、MD组和HD组的评分均低于MC组，且HD组

表1 各组小鼠结肠组织的组织形态学评分比较

与BC组及NC组比较:1)P<0.05；与MC组比较:2)P<0.05；与LD组比较:3)P<0.05；与MD组比较:4)P<0.05；下表同

表2 各组小鼠结肠组织中TLR4及NF-κB p65蛋白的表达水平及IL-1α、TNF-α、IL-13的浓度比较

2.3各组小鼠结肠组织中IL-1α、TNF-α、IL-13的浓度比较 各模型组小鼠结肠组织中IL-1α、TNF-α的浓度均高于BC组和NC组，差异有统计学意义(P<0.05)，而BC组和NC组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；各模型组小鼠中，LD组、MD组、HD组小鼠IL-1α、TNF-α浓度均低于MC组，且HD组0.05)。见表2。

3 讨 论

UC是结直肠部位发生的一种自身免疫性疾病，病变呈弥漫性改变，多由直肠段开始，累及全段结肠，内镜下可见肠壁黏膜多发性溃疡、周围组织充血水肿。患者多以病因不明且迁延不愈的腹痛、腹泻、便血为主要临床表现。据统计，随着经济的发展及居民饮食习惯等因素的改变，我国UC患病率已超过11.6/10万，成为肠道主要疾病之一，且UC还可能参与结直肠癌的发生发展过程〔9〕。而目前临床药物对于UC的治疗效果并不理想，且存在复发率高、不良反应多、不宜长期服用等缺陷〔10〕，雷公藤多苷是从中药雷公藤中精炼分离得到的抗炎物质，主要由二萜内酯、生物碱及三萜内酯等生物学活性成分组成，素有“中草药激素”之称，在风湿、类风湿关节炎、肾小球肾炎、小儿紫癜等免疫性疾病的治疗中发挥重要作用〔11〕。

目前对于UC的病因及发病机制尚不明确，学者普遍认为其发生发展涉及遗传、地域、免疫、环境、肠道菌群、饮食习惯等多种因素〔12〕，其中免疫因素在其中发挥主导作用。近年来TLRs/NF-κB信号通路在各类变应性疾病发生机制中的作用成为学者们研究的焦点。TLRs是一类Ⅰ型细胞跨膜蛋白，广泛表达于单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞中，也可表达于表皮细胞、成纤维细胞等非免疫细胞中。其可通过识别细菌、病毒等外源性配体及宿主自身释放的热休克蛋白、透明质酸等内源性配体，并与之结合，启动细胞内的信号转导途径，调节细胞内的免疫平衡〔13〕。TLR4是首个被发现的TLRs，是介导内毒素/LPS发生应答反应的最重要受体。人类正常结肠上皮细胞中，TLR4呈低表达且TLR4信号通路中的关键共受体MD2不表达。因此正常肠黏膜对LPS呈低反应性；而当结肠黏膜出现炎症反应时TLR4呈高表达状态〔14〕。NF-κB是一类广泛存在于人体细胞中的核转录因子，在人体的生长发育、炎症反应、损伤修复等活动中发挥重要调控作用〔15〕。通常情况下其由P50和P65两种亚基组成，其中P65是其主要活性成分。静息状态下，NF-κB与IκB-α以非共价键的形式结合，在细胞内以失活状态存在；而当细胞受到外界刺激时，IκB激酶被激活并降解IκB蛋白，从而解离NF-κB与IκB-α的结合物，使NF-κB活化并转移至细胞核内与靶基因DNA结合，进而发挥促进细胞增殖及炎症因子释放等多种生物学功能，炎症因子的分泌与表达可进一步激活NF-κB，使其形成正反馈调节，放大炎症反应〔16〕。

本实验结果显示说明雷公藤多苷对UC小鼠的结肠组织病理损伤具有显著改善作用，且其改善作用与雷公藤多苷的剂量有关，高剂量组改善效果更为明显。本文进一步对雷公藤多苷的作用机制进行研究，结果说明小鼠在UC状态时，结肠黏膜的TLR4/NF-κB p65信号通路可被激活，从而促进其下游促炎症因子的释放；雷公藤多苷可对UC小鼠的TLR4/NF-κB p65信号通路产生抑制作用，下调其下游促炎症因子，而对抗炎细胞因子IL-13不产生调控作用。

综上所述，不同剂量雷公藤多苷可对UC小鼠的结肠组织损伤具有不同程度的保护作用，且高剂量组效果更显著，而最佳适宜剂量仍需进一步研究。其保护作用机制可能与其对TLR4/NF-κB p65通路的抑制作用，进而下调其下游促炎症因子IL-1α、TNF-α的分泌和表达有关。

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