基于响应面法的微波辅助酶法提取核桃树叶单宁

（焦作职工医学院，河南焦作454000）

单宁作为一种广泛分布于植物中的多酚羟基结构化合物，水溶性好，不仅可与金属离子发生反应生成稳定的螯合物，同时还能与蛋白质、多糖、生物碱等发生反应[1]。单宁作为一种较高功能价值的植物提取物，在预防与治疗自由基所引起的疾病、抑制脂质、抗艾滋病等方面显示出独特的优越性[2]，尤其是其所具有的抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抑菌性等功能使其成为研究的热点[3]。广泛应用于医疗卫生、食品保健等多个领域。

目前，国内外单宁的生产多采用有水提取法、溶剂提取法、超临界流体萃取法等[4]。不仅提取时间长，单宁的生物活性也难以保证，抗氧化性能较弱。生物酶解技术是近年来发展起来的新型提取方法，通过生物酶破坏植物细胞结构，使胞内物质更易溶解、扩散，进而达到有效提取的目的，具有条件温和、提取物生物活性高等优点[5]。同时，微波辐射有机物提取技术，通过将能量快速传递，可加速细胞内有效成分的快速溶出，提高其反应活性[6]，从而提高酶解得率。近年来，生物降解与微波辐射技术由于符合“环保、绿色”要求而发展迅速。而响应面试验方法（response surface methodology，RSM）则可对试验结果进行有效优化[7]，获取最佳工艺。

本研究基于“绿色化学”的基本原则，以资源丰富的核桃树叶为原料，采用微波辅助纤维素酶法提取核桃树叶单宁。并通过RSM对提取工艺进行优化，拟提高得率，同时对所提取单宁的抗氧化性进行探讨。为从树叶中提取单宁、并确保单宁的活性提供一种切实可行的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

核桃（Juglans regia L.）树叶：采自山西省吕梁；纤维素酶（2×104U/mL）：诺维信生物技术有限公司（中国）；乙酸锌、乙醇、乙二胺四乙酸、铬黑T等试剂均为分析纯。

FH102微型植物试样粉碎机：湖北省黄骅市齐家务科学仪器厂；MKX-H1C1B常压微波合成/萃取反应工作站：青岛迈可威微波创新科技有限公司；SHY-2A水浴恒温振荡器：常州金坛市开发区吉特实验仪器厂；IRTracer-100傅里叶变换红外光谱仪：岛津企业管理（中国）有限公司。

1.2 提取方法与检测

1.2.1 原料预处理

用蒸馏水将核桃树叶洗净后放入鼓风干燥箱，在70℃温度下烘干至恒重，再用微型植物试样粉碎机破碎至50目。取粉末3.0 g，按1∶12的料液质量比配置后置于常压微波合成/萃取反应工作站，在设定的微波功率下处理一定时间后冷却至40℃，得到预处理液。

1.2.2 单宁的提取

加入一定质量分数的纤维素酶于预处理液中，然后加入200 mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液，调节pH值后放入常压微波合成/萃取反应工作站中，在一定的工艺条件下进行酶解后再提取一段时间，再冰浴冷却至室温，然后经减压、抽滤、干燥、粉碎得到核桃树叶单宁粗提物。同时，采取无微波辅助的条件下进行对比试验。

1.2.3 单宁含量测定

参照参考文献[8]中所提供的方法、采用乙酸锌络合滴定法测定单宁的含量。

式中：m1为纯化样品中单宁的量，mg；m2为绝干核桃树叶总质量，mg。

1.2.4 清除自由基能力检测

单宁对·OH、ABTS+·和DPPH·等自由基的清除能力检测参照参考文献[9]所提供的方法进行。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

以核桃树叶单宁的得率为指标，在探索性试验的基础上，采用单因素试验，考察微波功率、微波处理时间、酶解温度、酶解时间、酶液用量和缓冲液pH值对单宁得率的影响，以确定提取单宁的最佳条件。

2.1.1 微波功率和处理时间的影响

在温度60℃、酶液用量0.9%和缓冲液pH值为4的条件下将预处理液酶解100min。然后在微波功率分别为180、220、260、300 W的条件下进行提取，不同微波提取时间下单宁得率的变化关系见图1。

图1 微波处理时间和功率对单宁得率的影响Fig.1 Effects of microwave treatment time and powers on the tannin extraction yield

由图1可知，微波功率对单宁的得率有较大影响，随着功率的升高，单宁得率不断升高。但12min后，功率为260 W的得率与300 W的相接近，考虑到生产成本，将功率确定为260 W。同时，从图1中还发现，当功率为260 W时，12min后，单宁得率增幅趋缓，随着时间的延长，得率曲线几乎接近水平。这是因为微波能使有液泡类的细胞瞬间膨胀破碎而将胞内物质释放出来，在提取初期，时间越长，胞内物质释放物越多[10]，单宁的得率也就越高，随着时间的延长，胞内释放物的含量逐渐减少，单宁得率增加不明显。故将微波处理时间确定为12min。

2.1.2 缓冲液pH值和酶解时间对得率的影响

选取微波功率260 W、微波处理时间12min、酶解温度60℃及酶液用量0.9%，考察不同酶解时间和缓冲液不同pH值对单宁得率的影响见图2。

图2 缓冲液pH值和酶解时间对得率的影响Fig.2 Effects of buffer solution pH value and enzymatic time on the tannin extraction yield

结果如图2所示，在酶解时间为100min、缓冲液pH值为4.0左右时的核桃树叶单宁得率较高，而pH值低于或超过4.0后均较小。这可能是由于pH值为4.0左右时酶的活性较好的缘故，因此确定pH值为4.0。随着提取时间的延长，单宁得率逐渐增加，但当酶解时间超过100min后单宁得率降低。这可以解释为：一方面，随着提取时间的延长，单宁溶出的同时其它物质的溶出量也会增加。另一方面，提取时间过长也易使部分单宁类物质受到氧化等因素的影响而遭到破坏，从而导致得率降低[11]。故在本试验中选择100min作为酶解时间较为合适。

2.1.3 酶解温度和酶液用量对得率的影响

酶解温度对单宁的活性与得率等有直接关系。选取50、55、60℃和65℃作为酶解温度，在酶解时间100min、缓冲液pH值为4.0、微波功率260 W和微波处理时间12min的条件下进行试验，不同酶解温度和酶液用量与核桃树叶单宁得率的关系见图3所示。

图3 酶解温度和酶液用量对得率的影响Fig.3 Effects of enzymatic temperature and enzyme solution dosages on the tannin extraction yield

从图3中可见，相同条件下，酶解温度为60℃时得率最高。这是因为随着温度升高，酶的活性逐步增强，这有利于促进细胞壁水解。但是温度过高之后，酶活力会有所下降，部分酶甚至会失活，从而影响得率[12]。由此可见，并不是酶解温度越高越好，故在本试验中选取60℃作为酶解温度。在60℃时，酶液用量较低时，单宁的得率随着酶液用量的增加而增加明显，当酶液用量超过0.9%时，单宁得率增加缓慢。这可以解释为当酶的用量较大时，部分酶不能充分发挥作用所致。

2.2 响应面试验分析与优化

2.2.1 响应面试验设计

为了使单宁提取工艺更加合理与科学，在单因素试验的基础上，采用响应面试验方法（RSM）进行多因素的试验设计：以提取单宁得率为考查目标，选取微波功率、酶液用量、微波处理、酶解时间4个有重要影响的因素进行设计，见表1所示。

表1 响应面试验设计Table 1 RSM experiment design

根据单因素的试验结果，选取在酶解温度和缓冲液pH值分别为60℃和4.0，根据表1中的设计方案进行响应面试验，响应面试验结果见表2所示。

2.2.2 多元回归模型分析与验证

根据Box-Behnken设计原则，运用Design-Expert

表2 响应面试验结果Table 2 Results of RSM

7.1.6软件进行二次多元回归分析，得到如表3所示的模型与方差。

续表3 模型与方差Continue table 3 Model and variance

从表3中可知，模型的P值＜0.000 1，表现为非常显著，而失拟项P＞0.05，表现为不显著，且复相关系数R2=0.929 1，接近1，这表明模型与实际情况吻合程度较高。同时，AB和BC的P值均小于＜0.05，表现出具有交互作用。

通过响应面分析，可得到回归方程（2）：

在回归方程中，4个二次项系数均为负值，表明所选的4个因素均具有最大值，且AB和BC等几因素具有交互作用，其三维响应面图见图4。

图4 响应面三维图Fig.4 3D diagrams of RSM

从图4（a）中可见，随着酶液用量的增加，单宁得率增加缓慢，这可能是由于酶液达到一定量之后趋于饱和状态而不能发挥作用所致；而随着微波功率的增加，得率达到峰值后降低，这可以解释为较大功率的微波会分解部分单宁。在图4（b）中显示了微波处理时间与酶液用量之间的交互关系，随着微波处理时间的延长，但得率有降低的趋势，这同样可认为是由于微波对单宁的分解所致。因此，在本试验条件下，应该严格控制微波的功率与处理时间。

通过响应面分析，得到较优化的工艺参数为：微波功率249 W、酶液用量1.1%、微波处理时间10.04min、酶解时间101.24min，单宁的得率可达6.17%。为了便于试验控制，将微波功率、酶液用量、微波处理时间、酶解温度、酶解时间及缓冲液pH值分别设置为250 W、1.1%、10min、60℃、100min和 4.0，进行验证性试验，3次平均得率为6.08%，与模型所预测的6.13%很接近，这表明所建立的回归模型具有较好的预测性。同时进行对比性试验，其它条件相同，未采用微波处理的单宁得率仅为4.37%，两者相差1.71%。

2.3 单宁性能分析

2.3.1 红外光谱分析

将提取的核桃树叶单宁进行提纯，然后进行红外光谱分析，其红外谱图见图5。

图5 产物的红外光谱图Fig.5 FT-IR spectra of the extraction

由图5可知，其最能表征单宁特性的红外光带为1610cm-1和1517cm-1附近的芳基环振动；在1735cm-1附近有属于苯基酯C=O伸缩振动；1 445 cm-1为C-H变形和芳基环振动；1 190、1 041 cm-1处为C-H的伸展振动；在835 cm-1附近有吸收峰，说明有苯环的存在；而760 cm-1附近的特征峰表明苯环上有多个取代结构。此外，在3 400 cm-1附近峰形变得宽且强，属于酚羟基O-H伸缩振动；比对相关文献[13]发现提取物中含有单宁的主要成分——无色花翠素-3-葡萄糖苷分子结构类物质。

2.3.2 抗氧化能力分析

为了对比分析单宁的抗氧化性能力，将水回流提取法、超声波提取法及微波辅助纤维素酶法所得到的单宁对·OH、DPPH·和ABTS+·清除的情况进行对比，结果见表4。

表4 不同提取方法的单宁抗氧化能力Table 4 Antioxidant ability of tannin extracted with different method

由表4可知，在本试验条件下，采用微波辅助纤维素酶法提取单宁的IC50值分别为0.24、0.032 mg/mL和0.43 mg/mL，均远低于采用水回流提取法及超临界萃取法所得到样品的值，这表面其清除自由基的能力强。这可能是因为在水回流和超临界提取过程中核桃树叶单宁容易受到长时间加热、光照等外部条件的影响而发生氧化、异构等变化所致[14]。而微波辅助纤维素酶工艺可使提取温度降低、提取时间缩短、防止高温下单宁的氧化，因此不会对单宁分子结构与理化性质有过大的影响，并能保持生物活性。

3 结论

1）采用微波辅助纤维素酶提取核桃树叶单宁，与单独使用酶法相比，不仅可以有效的提高单宁得率，而且还能缩短提取时间。

2）选择酶解温度和缓冲液pH值分别为60℃和4.0，最佳提取工艺条件为：微波功率250 W、酶液用量1.1%、微波处理时间10min、酶解时间100min。在此工艺条件下，核桃树叶单宁的得率可达6.08%，比无微波辅助处理的提高了1.71%。

3）微波辅助纤维素酶法所提取的单宁具有较好的活性，对·OH、DPPH·和ABTS+·等自由基的清除能力均高于水回流提取法及超临界提取法的样品。

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