基于转录组测序分析宫颈病变中人乳头状瘤病毒16感染对泛素蛋白连接酶、核因子-κB表达的影响

马敏丽，美力班·吐尔逊，王振芳，阿仙姑·哈斯木

(1新疆医科大学研究生学院，乌鲁木齐　830011；2解放军第四七四医院病理科，乌鲁木齐　830013；3新疆医科大学基础医学院病理解剖学教研室，乌鲁木齐　830011)

基于转录组测序分析宫颈病变中人乳头状瘤病毒16感染对泛素蛋白连接酶、核因子-κB表达的影响

马敏丽1,2，美力班·吐尔逊3，王振芳1，阿仙姑·哈斯木3

(1新疆医科大学研究生学院，乌鲁木齐830011；2解放军第四七四医院病理科，乌鲁木齐830013；3新疆医科大学基础医学院病理解剖学教研室，乌鲁木齐830011)

摘要：目的探讨新疆妇女宫颈病变中Toll样受体9(TLR9)和泛素蛋白连接酶(UBC)、核因子-κB(NF-κB)表达与人乳头状瘤病毒16(HPV16)感染的关系。方法以人乳头瘤病毒(HPV)分型基因芯片检测86例慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌组织HPV感染及分型；Illumina Hiseq测序平台对15例宫颈病变组织进行转录组测序；通过免疫组化SP法检测TLR9、UBC和NF-κB在慢性宫颈炎、CINⅡ-Ⅲ 和宫颈癌患者石蜡包埋组织中的表达水平。结果宫颈癌的HPV感染率为100%(41/41)，CINⅡ-Ⅲ的感染率为60%(15/25)，慢性宫颈炎的感染率为15%(3/20)，其中HPV16为主要感染型别；转录组测序结果显示，HPV16阳性的宫颈癌和CINⅡ-Ⅲ组织中与TLR9相关的差异上调表达的基因有12个(NF-κB、UBC、TICAM1、POU2F3、S100A8、NOD2、CDK1、FOS、JUN、MAL、IRF7和RP11-58O9.2)；免疫组化结果显示TLR9、UBC和NF-κB在CIN和宫颈癌组织中高表达，其表达水平呈正相关(r分别为0.510和0.469，P值均<0.001)。结论在宫颈癌发展过程中，HPV16感染可能通过泛素-蛋白酶体降解途径影响TLR9 蛋白表达，具体调控机制需要深入研究。

关键词：宫颈癌；人乳头状瘤病毒16；Toll样受体9；泛素蛋白连接酶；核因子-κB

中图分类号：R737.33

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2018)05-0534-05

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.003

基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金-联合基金(2017D01C227)

作者简介：马敏丽(1983- )，女，在读硕士，研究方向：肿瘤分子生物学。

通信作者：阿仙姑·哈斯木，女，博士，教授，博士生导师，研究方向:妇科肿瘤,E-mail:axiangu75@126.com。

本文引用：马敏丽，美力班·吐尔逊，王振芳,等.基于转录组测序分析宫颈病变中人乳头状瘤病毒16感染对泛素蛋白连接酶、核因子-κB表达的影响[J].新疆医科大学学报，2018,41(5):534-538.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.003

EffectofHPV16infectionontheexpressionofUBCandNF-κBincervicallesionsbasedontranscriptomesequencing

MAMinli1,2,MeilibanTuerxun3,WANGZhenfang1,AxianguHasimu3

(1GraduateSchool,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011，China；2No.474People′sLiberationArmyHospital,Urumqi830013;3DepartmentofPathologyandAnatomy,SchoolofPre-clinicalMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between the expressions of Toll-like receptor 9(TLR9),Ubiquitin ligases(UBC),Nuclear factor-κB(NF-κB)and human papilloma-virus(HPV)16 in cervical lesions of Xinjiang women.MethodsEighty-six cases of Uyghur chronic cervicitis,cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and cervical cancer HPV infection and typing were detected by HPV typing gene chip;Illumina Hiseq sequencing platform was used for transcriptome sequencing of 15 cervical lesion tissues.The expression of TLR9,UBC and NF-κB in paraffin-embedded tissues of patients with chronic cervicitis,CIN Ⅱ-Ⅲ and cervical cancer were detected by immunohistochemical SP method.ResultsThe HPV infection rate of cervical cancer was 100%(41/41),the infection rate of CIN Ⅱ-Ⅲ was 60%(15/25),and the infection rate of chronic cervicitis was 15%(3/20),of which HPV16 was the major infection type.Transcriptome sequencing results showed that there were 12 TLR9-related different up-regulated genes(TLR9,NF-κB,UBC,TICAM1,POU2F3,S100A8,NOD2,CDK1,FOS,JUN,MAL and IRF7)in HPV16-positive cervical cancer and CIN Ⅱ-Ⅲ tissue.Immunohistochemistry results showed that TLR9,UBC9 and NF-κB were highly expressed in CIN and cervical cancer tissues,and their expression levels were positively correlated(r=0.510 and 0.469,P<0.001,respectively).ConclusionHPV16 infection may affect the expression of TLR9 protein in women through the ubiquitin-proteasomal degradation pathway,in which the specific regulatory mechanisms need to be further studied.

Keywords:cervical cancer;human papillomavirus 16(HPV 16);cervical cancer;Toll-like receptor 9(TLR9);ubiquitin ligases(UBC);nuclear factor-κB(NF-κB)

人乳头瘤病毒(HPV)是导致宫颈癌病变的主要因素，尤其是高危型HPV16、18长期持续感染是引起宫颈上皮癌变的重要原因[1]。Toll样受体(toll-like receptor,TLR)家族在早期固有免疫中对入侵病原微生物的识别发挥重要作用[2-3]。目前，已发现的人类TLR家族成员中识别病毒的有:TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和 TLR9,其中TLR9能识别细菌、病毒的核酸成分，通过介导下游信号转导诱导免疫反应[4-5]。课题组前期在宫颈癌组织标本以及宫颈癌细胞系中，对TLRs及相关分子进行检测，发现HPV16 阳性宫颈癌组织和细胞系中TLR9表达缺失[6]；并且利用RNAi技术抑制HPV16阳性宫颈癌细胞中E6、E7 mRNA表达，结果发现siRNA干扰引起肿瘤细胞表面TLR9分子的重新表达。以上研究证明宫颈癌组织TLR9表达缺陷与高危型HPV16编码的E6、E7蛋白有密切联系[7]。可见，TLR9信号转导途径的调控发生异常可能是HPV和肿瘤细胞赖以生存的必要前提或必然结果[8]。目前关于任何TLR及其功能途径、宫颈癌进程和HPV感染等三者之间关系尚未形成系统认识，甚至对TLR9表达调控与宫颈癌的关系也存在争议。综上，本课题旨在探讨新疆妇女宫颈病变中TLR9和泛素蛋白连接酶(UBC)、核因子-κB(NF-κB)表达与HPV16感染的关系。

1　材料与方法

1.1研究对象收集2015-2017年在新疆医科大学第一附属医院病理学诊断确诊的慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌(CSCC)患者的石蜡包埋组织标本共86例。其中包括慢性宫颈炎石蜡包埋标本20例，CINⅡ-Ⅲ石蜡包埋标本25例，宫颈癌石蜡包埋标本41例(高分化鳞癌21例，中低分化鳞癌20例)。其中15例宫颈病变新鲜组织进行转录组测序(分别为正常宫颈HPV阴性、正常宫颈HPV16阳性、CINⅡ-Ⅲ HPV16阴性、CINⅡ-Ⅲ HPV16阳性和宫颈癌HPV16阳性组织各3例)。

1.2主要仪器与试剂ABI9700PCR扩增仪、Illumina Hiseq测序平台。免疫组化SP法检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司产品)、UBC兔抗人多克隆抗体[Abcam(上海)贸易有限公司]、NF-κB兔抗人多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)和TLR9兔抗人多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。

Arzberg在 1920 年末与Hermann Gretsch大师合作推出新系列“1382”而名垂千史，该系列产品从1931 年便炙手可热，有一位评论家给“1382”极高的评价，称之“实用、朴实，简洁的风格比肤浅的时尚更具经典意义”。

1.3方法

1.3.1组织HPV基因型检测采用ABI9700PCR扩增仪和人乳头瘤病毒(HPV)分型基因芯片检测阅读系统(HPV-GenoCam-9600)进行结果判读。提取组织DNA，取2μL待测DNA样品分别加至上述PCR反应管中。PCR的循环参数设定为：预变性50℃2min，95℃10min，然后95℃30s，52℃45s，65℃30s，共40循环，总延伸65℃5min，扩增完毕后将产物保存在-20℃冰箱。DNA杂交：转移基因芯片至96孔板内，取30μL的NaOH变性液加入PCR产物管，静置10min。100μL的杂交液和60μL变性的PCR产物分别加入芯片孔中，在55℃下温育30min，并吸干孔内的液体。再加入150μL洗液B，漂洗3min，再次吸干液体；重复2次。显色：取100μL的酶标工作液，加入芯片孔内，在37℃下温育30min；将孔内液体吸干。再分别加入显色液A水溶液和显色液B，两者均为50μL，轻摇混匀，于室温下显色5min，然后将孔内液体吸干，并加入150μL洗液C，静置1min，并吸干。使用HPV分型基因芯片检测阅读系统对基因芯片进行检测和分析。HPV-GenoCam-9600系统自动检测靶点信号Intensity Value值(INS)，分析并报告结果：INS<11.0为HPV 阴性；INS≥11.0为HPV阳性，并报告HPV的型别。

1.3.2基于HiSeq 平台对宫颈病变组织进行转录组的测序 实验采用Illumina TruseqTM RNA 试剂盒方法构建文库。(1)提取总RNA、富集mRNA：从组织中提取总RNA，用Nanodrop 2000 检测所提取的RNA 的浓度和纯度，通过琼脂糖凝胶电泳法来检测RNA 的完整性，再用Agilent2100 测定RIN值。用带有Oligo(dT)的磁珠与ployA 进行A-T 碱基配对，将mRNA从总RNA中分离出来，用于分析转录组信息。(2)mRNA的片段化：富集所获得的mRNA序列是完整的，长度达几kb，因此要将其随机打断。(3)cDNA的合成：加入六碱基随机引物并通过逆转录酶的作用，以mRNA为模板逆转录合成单链cDNA，随后进行二链合成稳定的双链结构。(4)连接adaptor并Illumina Hiseq 4000 上机测序。

1.3.3采用免疫组织化学法检测TLR9和UBC、NF-κB蛋白表达情况用免疫组织化学SP法检测法，切片常规脱蜡，梯度乙醇水化及抗原修复并阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗(TLR9、UBC和NF-κB兔抗人多克隆抗体浓度分别为1∶250、1∶500和1∶300)，并放入4℃冰箱里过夜，用PBS作为阴性对照。第2天加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，室温下孵育30min。DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明和封片。判断结果，采用人工计数方法按染色细胞数和染色程度综合计分。光学显微镜下全视野观察，每张切片按所见阳性细胞范围分为4个分值，阳性细胞范围<5%记0分，5%～25%记1分，26%～75%记2分；>75%记3分。染色强度的判定：阴性染色记0分，弱阳性染色记1分，阳性染色记2分，强阳性染色记3分。综合积分=(染色细胞分数+染色强度分数)/2。

2　结果

2.1宫颈病变中HPV感染和基因型分布对86例宫颈病变标本进行HPV的检测，其中包括宫颈癌41例，CINⅡ-Ⅲ 25例，慢性宫颈炎组织20例。宫颈癌的感染率为100%(41/41)，CINⅡ-Ⅲ的感染率为60%(15/25)，慢性宫颈炎的感染率为15%(3/20)。在HPV阳性的标本中有11个HPV基因型，在66例宫颈癌及CINⅡ-Ⅲ组织中有10例为多重感染，多重感染率为15.1%(10/66)。在20例慢性宫颈炎组织中有3例感染了HPV，且都是HPV16阳性。在检测到的12个HPV基因型中高危型为10个，低危型2个。宫颈癌及CINⅡ-Ⅲ的HPV基因型分布，见图1。

2.2宫颈病变中与HPV16感染和TLR9相关的差异表达基因使用Illumina Hiseq测序平台4000对宫颈病变组织进行转录组测序，构建Illumina PE文库(200bp)进行2×151bp测序，对获得的测序数据进行质量控制，之后利用生物信息学手段对转录组数据进行分析，HPV16阳性的宫颈癌和CINⅡ-Ⅲ组织中与TLR9相关的差异上调表达的基因有12个，见表1。

表1　HPV16阳性宫颈癌和CIN组织中与TLR9相关的差异上调表达的基因

2.3宫颈病变中TLR9、UBC和NF-κB蛋白表达TLR9、UBC和NF-κB在病变宫颈组织中呈强阳性表达，TLR9主要表达在病变宫颈鳞状上皮的细胞膜和细胞质，UBC主要表达在病变宫颈鳞状上皮的细胞核和细胞质，NF-κB主要表达在病变宫颈鳞状上皮的细胞核和细胞质，见图2。

TLR9、UBC和NF-κB在慢性宫颈炎、CIN、宫颈癌中呈不同程度的阳性表达。在慢性宫颈炎组织中阳性表达率分别为40%、25%、50%，在CIN组织中阳性表达率分别为100%、88%、88%，在宫颈癌组织中阳性表达率分别为54%、73%、73%。随着宫颈病变程度的加重，TLR9、UBC和NF-κB的表达差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

2.4TLR9与UBC9、NF-κB表达水平的相关性TLR9在宫颈病变组织中的高表达与UBC、NF-κB的表达呈正相关(P<0.05)，Spearman相关系数r值分别为0.510和0469。UBC和NF-κB的表达也呈正相关(r=0.488,P<0.05),见表3、4。

慢性宫颈炎组织 CIN组织 宫颈癌组织

图2　TLR9、UBC、NF-κB在宫颈各组织中的表达(×200)

表2TLR9、UBC和IκBα在不同宫颈组织中的表达情况/例(%)

分类例数TLR9阳性阴性χ2值P值UBC阳性阴性χ2值P值NF-κB阳性阴性χ2值P值慢性宫颈炎组织208(40.0)12(60.0)5(25.0)15(75.0)10(50.0)10(50.0)CIN组织2525(100.0)0(0.0)20.6320.00022(88.0)3(12.0)21.3970.00022(88.0)3(12.0)8.020.018宫颈癌组织4122(53.7)19(46.3)30(73.1)11(26.9)30(73.1)11(26.9)

表3　不同宫颈组织中TLR9与UBC、NF-κB表达的相关性/例

表4　不同宫颈组织中UBC与NF-κB表达的相关性/例

3　讨论

宫颈癌是病因较明确的女性恶性肿瘤，80%的宫颈癌患者都能检测到高危型HPV的感染[9-10]。但绝大多数女性的感染为一过性感染,可在12～18个月内消除，只有少数(2%～3%)感染者免疫监视和清除功能失败导致其发展为宫颈癌[11]。所以机体的细胞免疫反应功能障碍被认为是HPV持续性感染并发展致癌的重要原因。

TLR9作为TLRs家族重要成员之一，和绝大部分TLRs共享髓系分化因子88(MyD88)介导的信号转导途径[12]。Liu等[13]、Sato等[14]的研究示当TLR9被配体激活后，MyD88将TIR二聚体与IRAK蛋白激酶连接，后者通过磷酸化激活泛素连接酶UBC，再经过多步反应，使NF-κB活化核转，导致免疫应答基因的激活，从而诱导多种细胞因子白细胞介素6(IL-6),肿瘤坏死因子α(TNF-α),干扰素α、β(IFN-α、β)和某些黏附分子等的表达，从而抑制细菌、病毒等病原体的感染。

本研究纳入86例宫颈病变组织标本，其中包括41例宫颈癌、25例CINⅡ-Ⅲ、20例慢性宫颈炎组织，分别对其进行HPV基因型检测、转录组测序和免疫组织化学染色分析。通过HPV基因型的检测，发现宫颈癌、 CINⅡ-Ⅲ和慢性宫颈炎的HPV感染率分别为100%、60%、 15%。并在HPV阳性的标本中共检测到11个HPV基因型，其中以HPV16为主要感染型别。并从中选取了15例宫颈病变组织进行了转录组测序，发现HPV16阳性的宫颈癌和CINⅡ-Ⅲ组织中与TLR9相关的差异上调表达的基因有12个,其中就包括UBC和NF-κB，因此我们推测UBC和NF-κB是与HPV16感染相关的TLR9靶基因。再以良性病变慢性宫颈炎为对照，通过免疫组织化学筛查分析，发现TLR9、UBC和NF-κB在慢性宫颈炎、CIN、宫颈癌组织中呈不同程度的阳性表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。由此说明TLR9参与了宫颈癌发生和发展的进程。且TLR9与UBC、NF-κB表达水平均呈正相关(r分别为0.510和0.469，P值均<0.001)。提示TLR9可能通过其信号转导途径激活UBC、NF-κB，并进一步通过NF-κB的下游靶基因的激活在宫颈癌的发生和发展中起作用。由此说明本研究进一步支持在宫颈癌发展过程中，HPV16感染可能通过泛素- 蛋白酶体降解途径影响TLR9 蛋白表达，但其具体调控机制还需要深入研究。

目前，TLR9在宫颈癌中所介导的表达调控机制仍不明确，只有通过多种TLR相关的基因表达调控水平筛查分析，鉴别出宫颈癌特异性TLR信号通路，才能深入开展TLR介导的天然免疫与宫颈癌进程之间相互作用的机制研究。在此过程中发现的关键信号分子也可为将来宫颈癌的药物治疗提供新的靶点。

[收稿日期：2018-02-27]

(本文编辑杨晨晨)