变温贮藏对中国水仙主芽ABA和GA相关基因的表达分析

姚婷婷 蒲小龙 叶露莹 宋敏娜 李小婷 叶如梦 宁俊楠 郭志雄 佘文琴 潘东明

摘 要 以3年生中国水仙品种‘金盏银台主芽为试验材料，经5和35℃变温贮藏水仙球，通过石蜡切片形态解剖学观察主芽活力，利用qRT-PCR方法分析水仙主芽在贮藏时期ABA和GA相关基因表达变化。结果表明，水仙主芽生长点的细胞排列紧密，35℃高温贮藏有利于水仙主芽的生长发育。qRT-PCR分析表明，贮藏期间ABA合成和代谢相关基因呈现不规则变化趋势，变温贮藏对NtABA2基因影响显著；GA相关基因整体呈下降趋势，变温贮藏对NtGA20X基因影响显著。

关键词 变温 ；贮藏 ；水仙 ；芽

中图分类号 S682.2+1 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.02.010

Abstract Bulbs of Narcissus variety Jinzhanyintai at the age of 3 years old were stored at the changing temperatures of 5 C and 35 C and was embedded in paraffin and cut into sections for morphological and anatomical observation of the vigor of their main buds. The change of the ABA and GA - related gene expression of the main buds of the bulbs during the storage was analyzed by using the qRT-PCR. The results showed that the cells of the main buds of Narcissus bulbs in the growth points were closely arranged， and their storage at the high temperature of 35 C was beneficial to the growth of Narcissus main buds. The qRT-PCR analysis showed that the genes related to ABA synthesis and metabolism tended to change irregularly， and that the storage at the changing temperature had significant effect on NtABA2 gene. The GA-related genes tended to decrease in general， and the storage at the changing temperature had significant effect on NtGA20X gene.

Keywords changing temperature ； storage ； Narcissus ； bud

中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）屬石蒜科水仙属多年生草本植物，具有很高的观赏价值，是中国十大名花之一，在春节开花，受到很多人的喜爱。中国水仙因夏季高温无法继续生长而以鳞茎芽的形式进入休眠，温度是影响水仙休眠的重要因素之一[1]，温度也是影响植物休眠解除重要的环境因素[2-3]。

温度不同对植物休眠解除结果也不同，高温（高于70℃）能够打破豆科种子物理休眠[4-5]，高温也可打破有些植物休眠。孙红梅等[6]发现，利用变温处理方式可解除百合鳞茎休眠；高东升等[7]和熊国胜等[8]发现，5℃是打破休眠的最佳温度，但是也有些植物是在0℃以下打破休眠，而某些植物在低于0℃的环境下反而促进休眠，夜晚-13～-4℃的温度可促进美国山核桃的芽萌发[9]。

脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）是影响植物生长的重要激素，其中ABA 是调控种子休眠和萌发重要的植物激素；赤霉素是广泛存在的一类植物激素，其功能是促进营养生长和打破休眠等。ABA合成和降解受到很多基因的调控，其中NtCYP和NtNCED是其合成的重要基因[10]，NtNCED 是其合成的关键酶，也是 ABA 整个生物合成过程中的关键调控酶[11]。赤霉素（GA）能够解除植物休眠，促进种子萌发，对植物生长起着重要的作用。

目前关于水仙休眠的研究很少与ABA和GA相关基因联系起来，尚未见类似的报道。本研究以水仙主芽为材料，测定变温贮藏对中国水仙主芽形态学和基因表达含量变化的影响，对进一步研究变温贮藏的水仙休眠机制具有重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为中国水仙‘金盏银台3年生的水仙球，来自福建省漳州市商业种植基地。试验处理：贮藏1组，将3年生中国水仙球置于5℃贮藏45 d后放到35℃中；贮藏2组，于5℃贮藏75 d放后放到到35℃中。2016年8月3日开始采样，第2次取样周期间隔30 d，之后每隔15 d取样一次，共取样5次。选取水仙球的主芽作为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 石蜡切片的制作材料处理和固定

用解剖刀取出主芽，立刻放到固定液FAA（5 mL甲醛+5 mL冰醋酸+90 mL70%乙醇）中，固定好后备用。

脱水。将固定后的材料，依次经过70%、85%、95%、100%乙醇脱水，每次2 h。

透明。用无水乙醇∶二甲苯（V∶V=1∶1）过渡2 h，二甲苯透明2次，每次1 h。

浸蜡。逐步往二甲苯中加入石蜡碎屑，二者体积比约为1∶1，放入37℃恒温箱内过夜，次日用含有石蜡和二甲苯（V∶V=3∶1）的溶液于58℃浸泡2 h，之后用纯石蜡于65℃浸泡1 h，连续换5次纯石蜡溶液，每次1 h。

包埋。提前打开包埋机和冷冻机，备好纸盒，将主芽放入纸盒内，用镊子固定好位置。

修蜡块和切片。根据所切的位置修整蜡块，将修好的蜡块粘在包埋盒上并做好标记；提前打开烘片机和展片机，将包埋盒置于自动切片机上，切片厚度约为10～12 μm，切片的过程中不断观察，直至切到所需的位置；将蜡条展开，用粘附性载玻片将蜡条平整地捞起，在烘片机上烘干。

细胞核染色。参照丁安琪[1]的方法，略作修改。将石蜡切片放入纯二甲苯中20 min，重复1次，转入无水乙醇∶二甲苯（V∶V=1∶1）溶液中5 min；分别用100%、95%、85%、70%、50%、30%乙醇浸泡5 min，接着分别置于蒸馏水中5 min，后置于苏木精染色液中30 min；染色后用自来水冲洗12 min，之后分别用30%、50%、70%、85%、95%、100%乙醇脱水，各3 min；脱水后置于无水乙醇∶二甲苯（V∶V=1∶1）溶液中3 min ，用纯二甲苯透明5 min，最后用中性树脂封片。

观察。用LEICA（DMi8）显微镜对主芽活力变化进行观察和拍照。

1.2.2 总RNA提取与cDNA合成

中国水仙总RNA提取参照Biospin多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（DNA-free）说明书提取。cDNA合成采用TAKARA公司的PrimeScript RT reagent Kit，具体步骤参照试剂盒说明书。

1.2.3 荧光定量PCR引物设计

内参基因和目的基因荧光定量引物均采用本实验室蒲小龙[12]实验设计中的引物（表1），选用actin基因为内参基因。

1.2.4 定量PCR反应体系及程序

参照TAKARA公司SYBR Premix Ex-TaqTM（Tli RNaseH Plus）说明书，在定量PCR仪中进行，PCR反应体系见表2。

2 结果与分析

2.1 水仙主芽活力分析

采用苏木精对中国水仙主芽进行染色，观察主芽生长点形态的改变和细胞核活力状况。结果显示，水仙主芽生长点往上呈三角形生长同时分化鳞片。贮藏2组主芽生长的速度较贮藏1组快，其生长点分化出的鳞茎变长且排列较稀疏。贮藏75 d后，贮藏1组水仙主芽生长点呈山峰状快速生长分化（图1-B1）；贮藏120 d后水仙主芽生长锥的染色程度深，细胞小而且与鳞片之间排列紧密（图1-E1）。贮藏1组主芽生长点染色程度比贮藏2组深，贮藏2组细胞排列稀疏而且生长点细胞大。于5℃贮藏45 d和75 d后水仙主芽生长点发育缓慢（图1-A1、1-B2），于35℃贮藏时水仙主芽生长点形态发育较快（图1- B2、1-C1、1-D1、1-E1）。

2.2 中国水仙主芽ABA和GA相关基因的相对表达量变化

对中国水仙球变温贮藏期间ABA和GA相关基因进行荧光定量分析，结果如图2所示，除了NtZEP和NtNCED外，其余基因均差异显著。

中国水仙主芽贮藏1组：ABA合成相关基因NtZEP和NtABA2表达量呈下降趋势，但NtABA2表达量贮藏75 d后明显下降且保持在较低的水平；NtNCED和NtAAO3表达量呈 “上升-下降”的变化趋势，贮藏75 d时基因表达量高于其它时期，贮藏75 d后呈下降趋势；ABA降解相关基因NtCYP表达量呈“下降-上升”的变化趋势。中国水仙主芽贮藏2组：ABA合成相关基因NtNCED和NtZEP表达量呈“下降-上升”的变化趋势，NtAAO3表达量呈“上升-下降”趋势，NtABA2表达量贮藏90 d后明显下降，随后保持在较低的水平；ABA降解相关基因NtCYP表达量呈下降趋势。贮藏1组NtCYP基因表达量在贮藏45 d时出现最大值，贮藏2组则在75 d时出现最大值，二者都是在5℃贮藏时出现最大值。

贮藏1组GA相关基因NtGA3OX表达量呈“上升-下降”的变化趋势，贮藏2组NtGA3OX呈上升趋势；贮藏1组NtGA2OX表达量呈“上升-下降-上升”的变化趋势，贮藏2组NtGA2OX表达量整体呈下降趋势；贮藏1组和2组NtGA20X表达量整体呈下降趋势，贮藏1组在贮藏45 d时出现最大值，贮藏2组在贮藏75 d时出现最大值，二者都是在5℃贮藏时表达水平高，35℃贮藏时表达水平低。

3 讨论

通过对中国水仙主芽进行形态学观察可知，高温贮藏有利于水仙主芽形态发育，低温抑制水仙主芽形态发育。5和35℃贮藏时水仙主芽生长点均分化鳞片，5℃贮藏45 d（1-A1）、75d（1-B2）主芽生長点均有活力，贮藏75 d时（1-B2）的活力高些，可能是由于随着5℃贮藏时间的延长，因贮藏温度过低导致生长代谢缓慢，能够在较长时间内维持主芽活力，故生长缓慢。于35℃中贮藏时，贮藏2组发育速度高于贮藏1组，表明高温能够促进水仙主芽形态发育。林小苹等[13]研究发现，储藏在高温条件下的水仙花球成花率明显高于低温条件下，可见高温对花芽分化有利，低温显著降低成花率。钟衡[14]研究表明，中国水仙主芽花芽在7月份上旬开始分化，8月份花芽分化形成花被，9月形成雌蕊和副花冠。郭蕊等[15]研究表明，东方百合杂种系的西伯利于3～5℃贮藏45 d后休眠解除，花芽开始分化；亚洲百合杂种系歌德琳娜于3～5℃贮藏30 d左右休眠被打破，种植1周后花芽分化。上述研究与本研究结论（5℃贮藏打破休眠）一致，但是5℃贮藏的中国水仙尚未完成花芽分化。

对ABA和GA相关基因表达水平进行分析可知，ABA合成途径中的相关基因表达水平并不一致，NtABA2于35℃中贮藏后，基因表达量很低，表明高温贮藏抑制了NtABA2基因表达，这与水仙遇高温进入休眠的结论基本一致，NtABA2基因在ABA合成过程中起着关键的作用。贮藏1组和贮藏2组NtZEP基因表达并无明显差异，在35℃贮藏时表达量均上升，2组表达水平基本一致，表明该基因维持35℃贮藏时水仙芽内部的ABA水平。贮藏1组NtNCED和NtAAO3呈先上升后下降的变化趋势，上升是因为该基因对35℃贮藏的胁迫反应，下降是由于随着贮藏时间的延长，35℃诱导NtNCED和NtAAO3表达量低。NtCYP基因表达呈下降趋势，于35℃贮藏后该基因表达量降低，是由于高温降低了ABA的降解水平。

对GA代谢相关基因相对表达量进行分析可知，NtGA3OX和NtGA2OX基因相对表达量较高。赤霉素合成相关基因NtGA3OX在35℃贮藏后，贮藏1组表达量先上升后下降，是由于水仙休眠被打破，赤霉素在这个阶段起着重要作用；贮藏2组表达量水平呈上升趋势，是因为该基因的表达受限于贮藏时间。贮藏1组NtGA2OX基因表达量先上升后下降随后又上升，贮藏2組整体呈现下降趋势，表明该基因表达量受35℃贮藏温度的影响。在35℃贮藏后NtGA2OX基因表达水平整体比较低，表明该基因表达受到35℃贮藏的抑制。

综上所述，变温贮藏只能够打破水仙休眠而无法完成花芽分化，正常水仙在种植50 d后开花，但是变温贮藏只能长出叶片，无法开花。从形态学观察得知，水仙主芽形态依旧是叶芽分化的状态。变温贮藏对ABA和GA相关基因表达水平有很大的影响，其中NtABA2、NtCYP和NtGA20X受35℃贮藏的影响比较大。

参考文献

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