慢性阻塞性肺疾病大鼠血液中炎症因子和神经相关分子水平的变化和意义

王小川 黄旭晴 高忠明 陶陈娟 姜海波

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种气流受限为特征的慢性呼吸系统疾病。近年来，COPD肺外系统病变也得到了广泛的重视[1]。研究发现，全身不良反应是COPD高发病率和高死亡率的主要原因。脑组织对缺氧极其敏感。COPD由于不可逆的气流受限，造成脑部长期慢性缺氧，最终会导致脑细胞损伤。另外，COPD患者全身系统性炎症也会加剧脑神经损伤[2]。我们前期研究发现，COPD患者长期缺氧导致了脑灰质细胞的丢失和体积减小[3-4]。本研究通过建立动物模型观察COPD脑损伤对外周血中炎症因子和神经相关分子水平变化，为临床COPD中枢病变的早期诊断、病情恶化和预后及治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料 2月龄雄性SD大鼠（200～250g）购于浙江大学实验动物中心。40只大鼠采用随机数字表法分成COPD组和对照组各20只。大鼠饲养室温控制在（23±1）℃，自由饮水和进食。COPD组大鼠建模：COPD组大鼠放置在熏烟箱（80cm×60cm×50cm）里连续烟熏4个月（3次/d，10支香烟/次，每次0.5h）。对照组除正常饲养外不作处理。

1.2 方法

1.2.1 肺功能检测 采用小动物肺功能仪（FinePointeTMNAM，Bucxo公司，美国）测试大鼠肺功能。3.5%的戊巴比妥钠腹腔注射（0.1ml/100g）麻醉，气管插管连接Bucxo数据记录分析系统。平静呼吸后，在呼气末以注射器经三通管迅速以相当于潮气量5倍的气量充气，然后立即脱开，连接负压（-25cm H2O）抽气造成深呼气。充气和抽气所引起的容积变化经计算机处理后计算出肺功能各项指标。

1.2.2 肺组织病理检查 肺功能测试后，两组大鼠立即断头处死。取左、右肺中叶依次经过多聚甲醛固定、脱水和石蜡包埋处理，组织5μm厚切片后脱蜡进行HE染色。

1.2.3 大鼠各指标检测 肺功能测试后大鼠断头取血，7 000r/min 4℃低温离心10min，取上清液-80℃保存。γ 干扰素（IFN-γ）、IL-1β、IL-6、C 反应蛋白（CRP）、TNF-α、中神经丝蛋白（NF）、神经特异性烯醇化酶（NSE）、Tau蛋白、脑钠素（BNP）、大鼠髓磷脂相关糖蛋白（MAG）、髓鞘碱性蛋白（MBP）和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（OMgp）试剂盒由美国ADL公司。采用多功能免疫荧光分析系统（芬兰WALLAC公司VICTOR 21420型）；采用双抗体夹心酶联免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法严格按照说明书操作测定各指标。

1.3 统计学处理 应用SPSS 16.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肺功能指标比较 与对照组比较，COPD组第50秒呼出容积占用力肺活量之比（FEV50/FVC%）为（33.0±2.8）%，明显低于对照组的（39.1±6.4）%，两组比较差异有统计学意义（t=3.441，P＜0.01）；COPD 组大鼠功能性残气量（FRC）为（6.0±0.7）ml，高于对照组的（3.7±1.1）ml，两组比较差异有统计学意义（t=6.975，P＜0.01）。

2.2 两组大鼠肺组织病理改变见图1。

图1 两组大鼠肺组织病理改变（a：对照组；b：COPD组）

由图1可见，COPD组气道壁明显炎症细胞浸润及杯状细胞增生，气道平滑肌和纤维组织明显增多，气道黏膜脱落，管腔狭窄，严重肺气肿形成。

2.3 COPD组大鼠外周血炎症因子水平变化见表1。

表1 COPD组大鼠和对照组大鼠外周血炎症因子水平变化

由表1可见，COPD组血浆IFN-γ、IL-1β、IL-6、CRP和TNF-α均高于对照组，两组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 两组大鼠外周血神经相关分子水平变化见图2。由图2可见，COPD组血浆NF、NSE、Tau蛋白、BNP、MAG、MBP及OMgp水平均高于对照组，两组比较差异均有统计学意义 （t=6.380、8.079、8.079、8.079、6.000、6.692、6.448、2.041，均 P＜0.05）。

2.5 COPD组大鼠外周血炎症因子与神经相关分子的相关性见图3。

由图3可见，COPD组大鼠MAG与IL-1β、BNP与IL-6、BNP 与 CRP 均呈显著正相关（r=0.595、0.386、0.429，均P＜0.05）；对照组大鼠MAG与IL-1β、BNP与CRP呈显著正相关（r=0.436、0.618，均 P＜0.05）。

3 讨论

国内外的资料分析均揭示吸烟是COPD形成的最主要危险因素[5-6]。在我国，吸烟者COPD患病率（15.7%）远高于不吸烟者（5.4%）[5]。本研究中，利用被动吸烟，我们成功地诱导了大鼠肺组织COPD病理改变及气肿样肺功能表现。吸入香烟中所含的尼古丁、亚硝胺、焦油和一氧化碳等有害物质均可引起呼吸道炎症反应，呼吸道内黏液分泌增加，进而阻塞气流通畅[7]。

图2 两组大鼠外周血神经相关分子水平变化（a：NF；b：NSE；c：Tau 蛋白；d：BNP；e：MAG；f：MBP；g：OMgp）

图3 两组大鼠外周血中炎症因子（IL-1β、IL-6和hs-CRP）与脑细胞释放分子（MAG和BNP）的相关性分析散点图

我们的研究揭示吸烟可以引起机体全身性炎症反应。这种炎症反应也可能反过来加重COPD的症状[8-9]。与我们在COPD组大鼠中发现相似，刘正会和李丽的研究表明，COPD患者外周血中CRP、IL-6和TNF-α的水平显著高于健康对照组。范春红等发现，COPD患者血清CRP、IL-1β和IL-17浓度水平较健康对照组均显著升高。Sebastian等[10]观察到在COPD稳定期患者血浆中CRP、IL-6、IL-8和TNF-α水平都显著升高，且IL-6和TNF-α的水平与疾病严重程度成正比。最近的研究[11]表明炎症因子IL-17和转化生长因子（transforming growth factor-beta，TGF-β）在 COPD 也显著升高。

与我们在COPD的发现类似，磁共振研究发现，急性高原暴露1个月人群和缺氧性发作性全面性遗忘症患者也存在低氧导致的脑损伤[12-13]。模拟海拔6 000M高原的低氧暴露大鼠脑内海马齿状回神经细胞发生了严重凋亡[13]。低氧情况下，神经细胞可通过改变其能量代谢，调节细胞内信号通路分子如蛋白激酶B（Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、一氧化氮及一氧化碳，调节脑源性神经营养因子（BDNF）及促红细胞生成素（EPO）和它的受体来应对低氧的影响[14]。低氧脑损伤的机制包括诱导神经细胞凋亡或自噬、释放氧自由基（ROS）产生氧化应激、活化PARP caspase非依赖途径诱导细胞死亡、激活小胶质细胞产生细胞毒性反应及免疫反应[15]。

研究表明，炎症反应过程是许多神经系统疾病，如精神疾病、癫痫、痴呆和神经退行性疾病的病因，并与疾病的临床发展相关[16]。慢性炎症能够破坏血脑屏障的紧密连接，因此使得外周血的促炎症因子进入脑内并激活小胶质细胞[17]。激活的小胶质细胞导致神经丝蛋白和髓鞘碱性蛋白丢失，进而发生脑室周围脑白质软化。在小鼠模型中发现，小胶质细胞能表达上皮模式识别受体如Toll样受体（TLR）1-9，神经元细胞可表达 TLR2、3、4、8。小胶质细胞介导的神经损伤依赖于TLR2和TLR4的完整表达。静态的小胶质细胞受到TLR激动剂激活，启动细胞因子和趋化因子的迅速上调。一些细胞因子也可以透过血脑屏障主动转运，或者由内皮细胞产生继而释放入邻近脑组织中[18]。

香烟中大量的细胞毒素，如一氧化碳、乙醛、亚硝胺和苯二酚等，可能直接导致了脑组织中神经细胞和胶质细胞的损害[19]。研究表明，吸烟可诱导Fas蛋白介导的大鼠脑组织细胞凋亡[20]。在阿尔茨海默病大鼠，吸烟后大鼠海马神经元损伤明显加重，胶质细胞变性明显[21]。体内、体外实验都证明暴露在烟雾中的缺血小鼠脑血流灌注能力以及毛细血管的密度均显著下降，在烟雾中暴露的缺血小鼠的HIF-1α和VEGF的表达量显著减少[22]。

总之，我们的研究揭示COPD可以导致脑神经细胞和胶质细胞同时受损。脑组织的损伤可能是COPD慢性缺氧、外周和脑内炎症因子及烟雾所含细胞毒素的共同作用结果。我们的研究结果为临床外周血检测COPD脑损伤及对其针对性治疗提供了理论依据。

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