块菌(松露)宿主可培养内生菌群落结构与多样性研究

叶 雷， 付 雨， 张笑萍， 孙 群， 张小平， 李小林

(1.四川省农业科学院 土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.四川大学 生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川 成都 610065；3.四川农业大学 资源学院，四川 成都 611130)

对于植物内生菌的定义一直存在争议，大致可以认为在植物体内能够引起植物病害的称为病原菌，而不引起病害或有益于植株生长并引起明显症状的微生物称为内生菌(Endophyte)[1-2]。植物内生菌包括细菌、真菌、放线菌，由于它们生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部，内生菌的存在和作用长期以来一直被忽视[3]。事实上，在已经研究到的植物中均发现内生菌的存在，它们可存在于植物的根、茎、叶、果实、花等各个部分[4-5]。块菌又称松露(Truffle)，具有独特的香味、口感和营养价值。在欧美等发达国家，块菌被称为“黑色金刚石”，是野生菌的极品，与鱼子酱、鹅肝酱同被称为三大珍品。华山松(PinusarmandiiFranch.)属于松科(Pinaceae)、松属(Pinus)的单维管亚束植物，为外生菌根型树种，可与块菌形成外生菌根，为四川省块菌产区大众宿主之一[6-9]。开展块菌宿主华山松内生菌群落差异研究，找出块菌宿主华山松所特有的菌群及其种属关系，探究块菌与华山松共生的优势菌群，对加速块菌的人工栽培及人工野外培育都具有积极影响。本文对四川会东块菌产区华山松内生菌的分离鉴定及遗传多样性进行研究，以明确块菌宿主华山松可培养微生物的分类地位，将分离的微生物作为良好的种质资源用于人工块菌菌根苗的开发和利用，推动块菌菌根苗的人工培育进程。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样地信息 四川省凉山彝族自治州会东县是中国西南地区重要的块菌产区之一，2016年产块菌40余吨。本研究所采集华山松样品来自会东县新田乡、新云乡、淌塘镇、雪山乡，经纬度范围为北纬N 26°22′57.85″～26°36′40.94″，东经E 102°32′50.18″～102°54′56.40″，主要的植被类型为华山松和云南松混交林，所选华山松来自中华夏块菌(Tubersinoaestivum)、印度块菌(Tuberindicum)、假凹陷块菌(Tuberpseudoexcavatum)菌塘，所选菌塘均有3年以上的产块菌史，会东地区的年平均温度为16.2 ℃，年降水量为1 099.7 mm，海拔范围为2 506～2 624 m。

1.1.2 样品采集及样品预处理 每个地区选取3个点，每点采集实验组(根、茎、叶)和对照组(根、茎、叶)各3个重复，每点按照5点取样法取样。对样品伤口部位立即涂抹75%的酒精消毒并装入无菌封口袋内，放入冰盒低温保存。采集的华山松根、茎、叶样品立即带回实验室，用流动水洗掉植物表面的泥土和灰尘，软毛刷轻轻刷洗，超声波清洗(150 W)15 min，无菌水冲洗3遍，滤纸吸干表面水分。对不能及时处理的材料，进行消毒处理后，-20 ℃冰箱保存。预处理的样品根、茎、叶部位各5 cm备用。

1.1.3 培养基 灭菌PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、Luria Bertani(LB)培养基、高氏一号合成培养基、ISP 4培养基。内生放线菌的分离采用HV培养基(P1)和改良高氏一号培养基(P4)。P1：腐殖酸 1 g，Na2HPO40.5 g，KCl 1.7 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，CaCO30.02 g，琼脂15 g，蒸馏水 1 000 mL;P4：可溶性淀粉 20 g，KNO31 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂20g，蒸馏水 1 000 mL。

1.1.4 材料与试剂 1%NaClO、吐温-80、10% NaHCO3；分子鉴定采用Biomiga EZgene细菌DNA试剂盒、D3 350-00 E.Z.N.A. TM Bacterial DNA Kit、D3 590-01 E.Z.N.A. TM Fungal DNA Midi Kit；引物合成由成都擎科梓熙生物技术有限公司完成，其中27 F和1492 R两段引物扩增细菌16S rDNA[10]，采用通用引物ITS 1和ITS 4[11]两段引物扩增真菌ITS序列；DNA Maker购自天根生物公司。

1.2 方法

1.2.1 样品表面消毒及效果检测 取预处理的样品根、茎、叶各5 cm左右，用无菌水冲1遍后在超净工作台上晾干，75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗3次，1%的NaClO(有效氯)溶液中加入1～2滴吐温-80，浸泡消毒20 min(不同的组织，根据情况酌情调整表面消毒时间以达到最佳的消毒效果)，无菌水淋洗样品5次(取最后淋出的一次水，涂布平板作对照，28 ℃倒置培养，剩余部分作为PCR模板，以培养基上是否长出菌落为标准，用于检测消毒效果，同时在工作台四角各放置1个PDA平板检测环境)，用10% NaHCO3溶液(灭菌)浸泡30 min，无菌滤纸吸干表面水分，将组织放入无菌研钵，加入10 mL无菌水，充分研磨成匀浆[1，12]。取少量匀浆液用无菌涂布器分别涂布于对应分离培养基平板上，28 ℃避光倒置培养，细菌培养3～5 d、真菌培养3～7 d、放线菌培养30 d后，挑选单克隆菌落进行划线分离纯化。

1.2.2 华山松内生细菌、真菌、放线菌的分离和培养 ①细菌培养：将上述研磨后的匀浆梯度稀释，分别涂布于牛肉膏蛋白胨培养基和LB培养基，同时分别涂布最后一次洗涤液作为对照。涂布好的培养基于30 ℃培养，待有菌落形成时，依据菌落形态的差异，分别挑取不同的内生细菌单菌落，纯化后于LB斜面4 ℃保藏。主要依据的形态特征：菌落大小，菌落形状，菌落边缘是否齐整，菌落颜色，菌落透明度，菌落光泽度以及菌落表面是否光滑，是否存在特殊结构[13]。②真菌培养：将上述研磨后的匀浆梯度稀释后涂布于加有抗生素的PDA培养基平板上，放置于25 ℃培养箱恒温培养，定期观察菌落生长情况，适时采用尖端挑取法转接于PDA平板纯化，最后在PDA斜面培养基中4 ℃保存备用。③放线菌培养：将上述研磨后的匀浆梯度稀释后涂布于改良高氏一号培养基(P4)，28 ℃黑暗倒置培养30 d。在放线菌菌落长出后，观察描述其菌落形态(去重复形态)及数量，进行计数统计。用HV培养基对菌落进行纯化(单菌落纯化3次以上)，并将纯化后的内生放线菌在HV斜面培养基(P1)4 ℃保存备用。

1.2.3 分子鉴定 华山松内生细菌、内生真菌的基因组DNA提取分别采用相应的omega细菌和真菌DNA提取试剂盒完成，内生放线菌采用Biomiga EZgene 细菌DNA试剂盒提取，提取方法均按照试剂盒说明书进行。PCR反应体系均为50 μL，其中2 ×TaqPCR Master Mix 25 μL，10 μmol /L 的引物各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O补齐至50 μL，PCR扩增程序如下：94 ℃预变性5 min，然后进入扩增循环，在每一个循环中先于94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，完成一个循环，共循环30次；最后72 ℃延伸10 min。利用1%的琼脂糖凝胶电泳对所收集的PCR产物进行检测，电压参数为100 V，通电时间为15 min。PCR产物送至成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。

1.2.4 序列分析构建系统发育树 将PCR扩增产物测序结果录入GenBank中进行BLAST分析，再用DNAMAN 6.0进行序列相似性分析，以Neighbor-joining方法构建系统发育树，用Bootstrap(1 000次重复)进行检验[14]。

2 结果与分析

2.1 内生菌分离

经过DNA分子鉴定，分离得到98株华山松内生菌，其中细菌46株，真菌19株，放线菌33株。从根部分离到细菌11株，真菌11株，放线菌6株；从茎部分离到细菌13株，真菌5株，放线菌11株；叶部分离到细菌22株，真菌3株，放线菌16株(见表1)。从表1 可知，根部细菌和真菌所占比例较高，尤其是华山松根部真菌数所占比例占可培养真菌数的57.89%，且所分离可培养的真菌均为子囊菌门，与块菌同属一个门，细菌与块菌的生长发育以及其特殊香味的形成也是密切相关的[15]。

分离出的细菌中欧文氏菌属(Erwinia)5株，沙门氏菌属(Salmonell)1株，杆菌属(Bacillus)22株，葡萄球菌属(Staphylococcus)2株，假单胞菌属(Pseudomonas)2株，类芽胞杆菌属(Paenibacillus)2株，布丘氏菌属(Buttiauxella)2株，肠杆菌属(Enterobacte)3株，爱文氏菌属(Ewingella)1株，泛菌属(Rahnella)1株，拉恩氏菌属(RahnellaIzard)2株，其他属1株。其中细菌菌株在系统发育树中基本分为3个大的分支，分别为杆菌属、假单胞杆菌属，以及含欧文氏菌属的多种细菌属，其中假单胞杆菌属均分离自华山松叶部，其他细菌在华山松的根、茎、叶部，分布无明显规律。

华山松的内生真菌在系统发育树中大致分为3个分支，以霉菌为主，而且所有的内生真菌均为子囊菌门(Ascomycota)，其中青霉属(Penicillium)4株，疱霉属(Phoma)1株，子囊菌门未知菌1株，篮状菌属(Cladosporium)1株，分枝孢子菌属(Sydowia)1株，曲霉属(Aspergillus)1株，其他10株。放线菌中链霉菌属(Streptomyces)22株，短小杆菌属(Curtobacterium)2株，短杆菌属(Brevibacterium)1株，其他属19株。

2.2 内生菌的系统进化地位

从NCBI数据库选取下载与华山松内生细菌和内生真菌菌菌株16S rDNA和18S rDNA序列相似性可靠的14株细菌菌株和l4株真菌菌株，将它们的序列用ClustalX软件进行比对，再用Mega 4.0程序中Neighbout-Joining方法建立系统发育树，结果表明内生菌与其亲缘关系近的菌株聚在一起(图1、图2)，相似性均达到了88%～99%。

2.3 序列分析构建系统发育树

用Mega 4.0程序中Neighbout-Joining方法建立系统发育树，掌握所分离菌之间的亲缘关系。分离得到98株华山松可培养内生菌，细菌46株，真菌19株，放线菌33株，如图1和图2，其菌株相似性均达到了88%～ 99%，对本研究所分离的青霉属(Penicillium)、疱霉属(Phoma)、篮状菌属(Cladosporium)、分枝孢子菌属(Sydowia)、曲霉属(Aspergillus)等，后续可用于探究华山松菌根形成是否与华山松内生真菌群间的关系，以研发块菌菌根接种微生物菌剂。

表1 内生菌种类Table 1 Endophyte species

表2 块菌宿主华山松不同部位内生菌分离信息Table 2 Endophyte from Pinus armandii different parts

注：部分菌株信息重复，未在表中列出

图1 块菌宿主华山松内生细菌进化树Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of bacteria

从图1和图2可以看出，本研究所分离的可培养菌株可信度较高，分离的真菌在系统发育树中大致分为3个分支，以霉菌为主，均为子囊菌门，并且本研究中分离到的来源于根部的子囊菌占较大比例(57.89%)，表明这些寄生于宿主华山松的子囊菌很可能主要来自菌塘土壤，并主要以根部进入植物内，说明根部是植物内生菌栖息的重要场所。

图2 块菌宿主华山松内生真菌进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on the ITS rDNA sequences of fungi

3 讨 论

本研究分离得到98株华山松内生菌，其中细菌46株，真菌19株，放线菌33株，分布于19个属，从根部分离的可培养真菌均为子囊菌门，与块菌同属一门，这可能与块菌的菌根形成有一定关系，在块菌子囊果中单孢菌为印度块菌的优势菌群，同时也是印度块菌与云南松菌根的根际土壤常见优势菌群，这与本研究有观点相同之处[16-17]。经上述分析，可发现来自不同地点、不同植株部位、不同培养基分离得到的块菌宿主华山松内生菌分布存在差异，有一定的分布特征，如根部分离可培养菌均为子囊菌门，叶部分离的细菌种属较多，其中华山松的根部可培养内生真菌种类和数量最丰富，这与游见明对茶树不同部位的内生真菌分布研究结果一致[18]，可推测根部可能是植物内生菌寄生或共生的主要部位。内生菌与植物所形成的共生关系存在相互协调作用，内生菌种类和数量可能会影响植物的生长，进而推测块菌宿主植物内生菌对块菌在植物根部的形成或生长有所影响。

寄生于块菌宿主华山松上的细菌种类较多，其中叶部的内生细菌含量最多，占所分离可培养微生物的46.94%。占最大比例的细菌是杆菌属，它们在华山松根茎叶均有分布且数量相当，杆菌属在松树中的存在之前已有报道，并发现该菌的存在与松树的线虫病相关，但对正常生长的松苗没有作用，是一种弱致病菌[19]。杆菌属的细菌在块菌宿主华山松中的作用研究尚未见报道，它的存在是否对松树的生长或对块菌的生长具有抑制作用还需要进一步的研究。

块菌与华山松之间属于共生关系，块菌的菌丝侵染植物根部形成外生菌根，形成真菌与植物的复合共生体。在本研究中，从华山松根部分离到的细菌、放线菌的菌落数目相当，有研究表明块菌生长的菌塘土壤中含量最大的真菌类群属于子囊菌门[20-21]，此外，富集于各类土壤的放线菌在华山松的根茎叶各部位中也占有一定比例，这反应了微生物与根系土壤、块菌、宿主之间的关系密切，弄清它们之间的相互作用对于块菌的人工种植具有十分重要的意义。本研究分离到的华山松内生可培养真菌均属于富含在块菌菌塘土壤中的子囊菌，表明块菌宿主华山松的植物内生真菌的分布可能受块菌存在的影响，关于块菌宿主植物内生菌群与块菌产品、品种之间的关系，有待进一步研究。

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