黄瓜白粉菌基因组DNA 提取方法比较

柳利龙 ， 张爱琴 ， 张 环

（1.甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，甘肃 兰州 730070）

黄瓜白粉病又称粉霉病、白毛病，是严重危害黄瓜的主要病害之一，具有潜伏期短、再侵染频繁、流行性强和周年发生等特点［1-3］。其主要为害叶片，影响叶片的光合作用，故通常在黄瓜生长过程中、后期发病重，造成黄瓜减产，甚至造成提前拉秧［4］。果实感染后不能正常膨大，呈瘦长形［5］，丧失商品价值。黄瓜白粉病病菌有2种，包括单囊壳白粉菌{Podosphaera xanthii［Sphaerotheca fuliginea（Schlecht）poll］}和二孢白粉菌［Golorinomyces cichoracearum（Erysiphe cichoracearum D C）］，我国黄瓜上多以单囊壳白粉菌Podosphaera xanthii为主［6］。2种白粉菌均属于子囊菌，都是严格的专性寄生菌，寄主范围广泛，主要集中在黄瓜、西葫芦、西甜瓜和南瓜等葫芦科作物［3，7-9］。因其无性阶段与报道的其他瓜类白粉菌结构非常相似，并且有性阶段的闭囊壳不易产生，所以给病原物的分类、鉴定工作造成较大的困难［10］。因此，若要有效防治黄瓜白粉病，澄清其病原体的种类将非常重要。

近年来，随着分子生物学的发展，用提取白粉病病原菌无性生殖阶段个体（分生孢子和菌丝）基因组DNA来鉴定、区分形态高度相似的白粉病病原菌，已成为重要的鉴定手段，其在形态鉴定基础上，不仅提高了鉴定的准确性，还缩短了鉴定时间［10］。在分子生物学鉴定病原菌工作中，DNA提取至关重要。目前，基于白粉菌基因组DNA提取方法方面的研究较多。刘建利等［10］利用Chelex-100法建立了快速提取甜瓜白粉菌基因组DNA的高效方法；万三连等［11-12］用3种方法提取了橡胶白粉菌基因组DNA，DNA产量OMEGA试剂盒法最高，生工生物试剂盒法最低，CTAB法介于两者之间；龚双军等［13］采用改进破壁法、液氮研磨法和溶菌酶消化法进行破壁，利用改良CTAB法提取微量小麦白粉菌基因组DNA，改进的破壁方法获得的DNA收率大且纯度高；朱海荣等［14］利用4种方法提取相同质量小麦白粉菌基因组DNA，结果显示提取率由大到小依次为改良CTAB法、电钻微量研磨一管法、FastPrep DNA试剂盒法、Chelex-100法。基于黄瓜白粉菌基因组DNA提取方法的比较研究报道较少。黄瓜白粉菌为专性寄生菌，病菌须在活体上保存、培养和繁殖，而且在繁殖过程中易受寄主生长条件等因素的影响，收集足以提取DNA的孢子需花费较长的时间长且工作量大，筛选或开发出用尽可能少的孢子提取出高质量DNA的方法至关重要。我们利用改良CTAB法、SDS法和真菌试剂盒法提取黄瓜白粉菌基因组DNA并进行了比较，以期筛选出提取黄瓜白粉菌基因组DNA的最佳方法，为黄瓜白粉菌的分子生物学研究、系统发育分析及抗药性分子机理等研究提供相应的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种：黄瓜品种“皇家101F1油亮型密刺黄瓜”（山东华诺种业有限公司），购于甘肃省农业科学院种子市场。

供试菌株：黄瓜白粉病菌采自实验室内培养发病的黄瓜植株叶片。

供试药剂：CTAB法提取缓冲液A（1.00 mol/L Tris-HCl， 0.50 mol/L EDTA， 20 g/L CTAB， 1.4 mol/L NaCl， pH 8.0）； SDS 法提取缓冲液B（0.05 mol/L Tris-HCl， 0.18 mol/L EDTA，10 g/L SDS，pH 8.0）。以上提取缓冲液均用无菌水配制，置于4 ℃冰箱备用。

1.2 试验方法

1.2.1 黄瓜白粉菌分生孢子收集 将黄瓜白粉菌分生孢子加入盛有0.5%十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液中，在10×10倍显微镜下镜检使其浓度为每个视野约50～60个分生孢子。采用涂布法接种，将配制的孢子悬浮液均匀地涂抹在植株的所有子叶和真叶上［15］，接种量至每个叶片上都布满孢子悬浮液为宜。然后将接种的幼苗置于温度为25 ℃、RH 60%、光照12 h和光照强度为4 400 Lx的光照培养箱中培养，培养14 d后，待叶片上产生大量分生孢子时在超净工作台上收集白粉孢子。将已发病的黄瓜叶片慢慢用镊子从培养基上取下放在琉璃纸上，轻轻用镊子敲打2～3次，抖落大量的分生孢子后，再用细毛笔刷掉叶片上剩余的分生孢子，最后将收集到的所有白粉孢子刷进2 mL离心管中（可多次收集，每管中可分装50～100 mg白粉孢子），每收集完一批，将超净工作台用酒精擦拭灭菌，打开紫外灯并风吹10 min，以保证菌种间不互相污染。将收集完孢子的离心管置于干燥器中干燥3～5 d，置于－20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 黄瓜白粉病菌DNA的提取 改良CTAB法［16-17］。称取黄瓜白粉菌分生孢子0.6 g于灭菌的研钵中，加入适量石英砂和液氮迅速研磨，重复2～3次，使成细粉末状。用灭菌的钥匙将研磨后的分生孢子粉末转入1.5 mL离心管，依次加入750 μL DNA 提取缓冲液 A、 65 μL 10%CTAB、150 μL 2.5 mol/L NaCl、 50 μL 10%SDS 溶液， 反复颠倒离心管使其混匀（动作轻缓），在65 ℃条件下水浴1 h，期间轻轻震荡3～4次。从水浴锅中取出离心管，室温下12 000 r/min离心8 min，取上清液于另一离心管中，并记录体积。上清液中加入等体积的氯仿·异戊醇，12 000 r/min室温下离心10 min，取上清液于另一离心管中，重复抽提1次。在上清液中加20 μL RNase酶，37 ℃水浴1 h；加入等体积的预冷无水乙醇，置于－20 ℃冰箱中3 h或过夜，沉淀DNA。取出离心管，12 000 r/min室温下离心15 min，弃上清液。用70%乙醇和无水乙醇各洗1次（去除残杂），在超净工作台上风干（40～60 min）；加入50 μL TE缓冲液溶解DNA，放入－20℃储存或放入4 ℃下待用。

SDS法［18］。称取黄瓜白粉菌分生孢子0.6 g于灭菌的研钵中，加入适量石英砂进行研磨，使成细粉末状。用灭菌的钥匙将研磨后的分生孢子粉末转入2 mL离心管中，加入700 μL DNA提取缓冲液B，涡旋震荡8～10 min，每隔30 s上下晃动10 s。在65 ℃条件下水浴90 min，期间轻轻颠倒离心管4～5次，加入600 μL 7.5 mol/L NH4AC，冰浴10 min。取出离心管于12 000 r/min，室温下离心5 min，取上清液。上清液中加入1/10体积NaAC 3 mol/L和0.6倍体积预冷异丙醇，轻轻颠倒管子以混匀，冰浴20 min；12 000 rpm，室温下离心5 min，取沉淀。取200 μL TE缓冲液溶解沉淀，加入适量RNase酶，37 ℃条件下水浴1 h。加入200 μL氯仿·异戊醇，取上清液于1.5 mL离心管，重复抽提1次。上清液加入1/10体积NaAC 3 mol/L 和2.5倍体积的预冷无水乙醇，最大转速离心8 min，弃上清液。用75%乙醇和无水乙醇各洗1次去除残杂，在超净工作台上风干（40～60 min）。加入50 μL TE缓冲液溶解DNA，放入－20 ℃下储存或放入4 ℃下待用。

真菌试剂盒提取法，具体步骤参照DNA Fungal DNA Kit使用说明书。

1.2.3 提取DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 将50×TAE缓冲液稀释成1×TAE缓冲液来制备1.0%琼脂糖凝胶（含0.5 μL/mL溴化乙锭），电泳鉴定提取的DNA。取5 μL DNA，加入3 μL溴酚蓝混匀，然后在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，一侧加Marker（上海生工生产的DNA Marker D，分子量分别为 2 000、 1 000、 750、 500、 250、 100 bp）为分子量对照，于100 V下电泳30 min，在紫外光（254 nm）下观察抽提结果，然后在凝胶成像系统中观察并拍照。

1.2.4 DNA质量体积分数及提取率计算 各取3 μL DNA稀释（稀释倍数为10），以稀释所用超纯水为对照，用CARY-50（Varian，美国）分光光度计测其在260 nm和280 nm波长处的光吸收值、R值（在1.8～2.0为高质量 DNA）［11，19-20］。

DNA 质量体积分数（μg/mL）=OD260×50×稀释倍数

总DNA量（μg）= DNA浓度（μg/mL）×体积（mL）

DNA产量（μg/g）=总DNA量（μg）/菌重量（g）

R=A260/A280表示DNA在波长260 nm和280 nm处的吸光值比值。

2 结果与分析

2.1 DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果

通过3种方法提取黄瓜白粉菌基因组总DNA，观察白粉菌DNA电泳检测条带，结果表明，真菌试剂盒法提取的白粉菌DNA电泳检测条带（图1 A，B，C）暗，杂质较多，有拖尾现象；SDS法提取的白粉菌DNA电泳检测条带（图1D，E，F）较亮，但杂质较多，且部分有降解，出现拖尾现象；CTAB法提取的白粉病菌DNA较为完整，电泳检测条带（如图1 G，H，I）清晰，亮度高，基本无拖尾现象。3种方法提取的白粉菌DNA电泳检测条带亮度依次为CTAB法、SDS法、真菌试剂盒法。

图1 黄瓜白粉病菌基因组DNA凝胶成像电泳图

2.2 DNA浓度及提取产率分析

测定了黄瓜白粉菌DNA的A260和A280，结果表明，3种方法获得的DNA无论从数量还是质量上都有显著区别（表1）。CTAB法和SDS法提取白粉菌DNA质量较高，其R值均大于1.8，分别为1.969 6和1.832 2；而真菌试剂盒法提取得白粉菌DNA质量较低，其R值小于1.8，为1.507 9。用CTAB法提取到的 DNA产量达 204.30 μg/g，比SDS法（产量147.70 μg/g）的效率高出38.3%， 比真菌试剂盒法（产量118.70 μg/g）的效率高出72.1%，且各方法提取的DNA产量之间差异极显著（P<0.01）。综上所述，3种方法提取的白粉菌DNA产量和质量由大到小依次为CTAB法、SDS法、真菌试剂盒法。

表1 不同方法提取黄瓜白粉菌DNA的测定结果

3 小结与讨论

分别利用改良CTAB法、SDS法和真菌试剂盒法提取了黄瓜白粉菌基因组DNA。通过比较分析，发现利用CTAB法提取的白粉菌DNA效果最佳，其次分别为SDS法和真菌试剂盒法。CTAB法提取的黄瓜白粉菌基因组DNA在纯度（R=A260nm/A280nm）和产量上均优于SDS法和真菌试剂盒法，且杂质少。CTAB法提取的黄瓜白粉菌基因组DNA产率为204.30 μg/g，而SDS法和真菌试剂盒法为147.70 μg/g、 117.70 μg/g， 且方法产率之间差异极显著。采用CTAB法提取的DNA纯度较高为1.969 6，SDS法和真菌试剂盒法较低分别为1.832 2和 1.507 9。

CTAB法在提取白粉菌基因组DNA过程中，研磨之前加入适量石英砂，同时还加液氮进行了速冻，因此破壁效果更好，获得的DNA产量最高，同时整个提取过程中不需多次抽提，步骤简单、成本低、提取的质量高，适合提取黄瓜白粉菌这种菌体较轻、难收集、易飞溅的专性寄生菌的DNA，这与龚双军等［13］、朱海荣等［14］提取小麦白粉菌基因组DNA时筛选出的方法相一致。改进的SDS法提取的黄瓜白粉菌基因组DNA，研磨前只加石英砂进行研磨，同时使用涡旋振荡器充分振荡混匀，虽避免了在提取过程中DNA的损失，但破壁效果较差，导致提取的DNA纯度和产量均较低。真菌试剂盒法破壁方法和CTAB法一样，但提取的DNA产量和质量较CTAB法低，这可能是裂解液的裂解不充分或其他方面的原因而影响了核酸释放。

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