微血管内皮细胞对小鼠造血干细胞增殖的影响

钱 怡，杨 敏，林凡莉，汪姝玥，李晓明，黄纯兰

(西南医科大学附属医院血液内科，四川泸州 646000)

造血干细胞(hemopoietic stem cells，HSCs)存在于造血组织，具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，是所有成熟血细胞的前体细胞。造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)是治疗恶性血液病、遗传性疾病及免疫缺陷病的重要手段之一。骨髓微环境对于HSCs的增殖、分化、迁移及归巢等具有重要的调控作用[1]。HSCT并非仅仅是单纯的HSCs输注，还包括骨髓基质细胞和其他造血调节因子的同时输注，以便更好、更快地重塑造血系统和免疫系统。然而，人骨髓中HSCs比例较低，极大地限制了HSCT的发展和临床应用。本文通过研究微血管内皮细胞(microvascular endothelial cells，MECs)对HSCs增殖的影响，建立一种促进HSCs增殖的方法。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 体质量20～25 g，4～6周龄，雄性或雌性，无特殊病原体(SPF)级C57BL/6小鼠(购自成都达硕生物科技有限公司)和C57系GFP小鼠(购自重庆腾鑫生物公司)。

1.1.2主要仪器与试剂 CO2培养箱(Thermo Forma公司)，超净工作台(Air Tech公司)，台式离心机(Bioridge公司)，倒置荧光显微镜及照相系统(Olympus公司)，流式细胞仪(BD公司)，质谱(MS)分离柱、mini MACS磁珠分选装置、CD117细胞分选试剂盒、小鼠白细胞介素(IL)-3、小鼠干细胞因子(SCF)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗鼠CD31(CD31-FITC)及藻蓝蛋白(APC)标记的CD117(CD117-APC)购自Miltenyi Biotec公司，血管内皮生长因子(VEGF)购自ACRO公司，Ⅰ型胶原酶、明胶粉购自Sigma公司，藻红蛋白标记的兔抗鼠CD34(CD34-PE)及多甲藻黄素叶绿素蛋白(PerCP)标记的CD45(CD45-PerCP)购自BD公司，羊抗八因子相关抗原(vWF)多克隆抗体、FITC标记的驴抗羊IgG(IgG-FITC)购自Abcam公司，Ficoll分离液购自TBD公司，DMEM-F12购自南京三生生物公司。

1.2方法

1.2.1MECs分离、培养及鉴定

1.2.1.1MECs的培养 MECs使用添加有20%胎牛血清(FBS)、2 ng/mL VEGF、100 U/mL肝素、0.1 mg/mL青霉素及链霉素的DMEM-F12完全培养基进行培养。

1.2.1.2MECs的分离与培养 颈髓离断处死小鼠，75%乙醇浸泡约5 min。逐层剪开胸腔，剥离肺组织外的脏层胸膜，剪取肺叶组织，除掉可见的支气管和大血管。剪碎肺组织至1 mm左右，装入离心管。加入与组织等量的含2%牛血清蛋白(BSA)和0.1%Ⅰ型胶原酶的消化液，吹打混匀，37 ℃摇床消化。每5分钟吹打1次，共消化约30 min。加入FBS和DMEM-F12终止消化，过200目滤网。300×g离心10 min，弃上清液。加入DMEM-F12重悬，400×g离心10 min，弃上清液，用DMEM-F12完全培养基重悬。经细胞计数及活力测定。以1×106个/cm2密度接种于0.1%明胶包被的24孔板，置于37 ℃、5% CO2、95%湿度培养箱培养。培养24 h后进行首次全量换液，此后每2～3天换1次，逐日显微镜下观察。0.25%胰蛋白酶消化“铺路石”样贴壁细胞用于流式细胞仪(FCM)鉴定和共培养。

1.2.1.3免疫荧光鉴定 第8天24孔板中的细胞2孔，设对照孔、实验孔，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后加4%多聚甲醛200 μL，室温固定15 min。去掉多聚甲醛，PBS洗涤2次，加入5% BSA封闭30 min。实验孔加5 μL CD31-FITC和45 μL PBS，对照孔加50 μL PBS，4 ℃冰箱避光孵育10 min。PBS洗涤后加100 μL 0.2% Triton X-100溶液，混匀，5 min后PBS洗涤。加入5 μL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和100 μL PBS，混匀，避光孵育3 min，PBS洗涤。荧光显微镜下观察采图，随机选取3个视野(×200)，计算阳性细胞百分率。

1.2.1.4流式鉴定 设对照管、实验管1、实验管2、实验管3，均加上述制备的细胞悬液200 μL(细胞数大于1×105个)。对照管加IgG-FITC、IgG-PE、IgG-PerCP各5 μL，实验管1加5 μL CD31-FITC，实验管2加5 μL CD34-PE，实验管3加5 μL CD45-PerCP，混匀，4 ℃避光孵育15 min。PBS洗涤，200×g离心5 min，去上清液。400 μL PBS重悬上机检测。

1.2.1.5vWF-FITC 流式鉴定 设置对照管、实验管，均加备用细胞悬液200 μL。离心后加200 μL 0.4%多聚甲醛重悬，室温下固定20 min，PBS洗涤离心后加200 μL 0.2%皂素溶液重悬，静置20 min，PBS洗涤离心。200 μL PBS混匀细胞。实验管加4 μL羊抗vWF多克隆抗体，对照管加4 μL羊IgG，室温孵育30 min。PBS洗涤离心后200 μL PBS重悬，加4 μL驴抗羊IgG-FITC，室温避光孵育20 min。洗涤，400 μL PBS重悬上机检测。

1.2.2GFP小鼠骨髓HSCs的分离、鉴定

1.2.2.1密度梯度离心与磁珠分选 颈椎脱臼法处死小鼠，置于75%乙醇中浸泡约5 min。逆向解剖法剥离股骨、胫骨，PBS冲洗。剪去骨端约2 mm，暴露髓腔。1 mL注射器插入骨髓腔，用PBS反复冲洗髓腔至发白，冲出的骨髓收集于离心管，过200目滤网。离心去上清液，加1 mL PBS重悬，混匀。加2 mL复温的Ficoll分离液(1.084 g/mL)于离心管，加样枪沿管壁缓慢加入上述细胞悬液。20 ℃ 400×g离心30 min。收集中间云雾层(即单个核细胞层)，以1∶3比例加入PBS稀释，制成细胞悬液，400×g离心10 min，弃上清液，重复1次。经活力测定及计数。加入预冷Buffer[0.5% BSA、2 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、PBS]3 mL，吹打混匀，22 ℃ 300×g离心10 min，弃上清液。按照每1×108个MNCs用80 μL预冷Buffer重悬，每1×107个MNCs加20 μL CD117微珠标记细胞，混匀，4 ℃冰箱避光孵育15 min。每1×107个MNCs用1 mL Buffer洗涤，300×g离心10 min，去上清液，每1×108个MNCs加入500 μL Buffer重悬。连接MACS分选装置，500 μL Buffer润湿MS柱，骨髓细胞悬液滴入MS柱，收集洗脱细胞。Buffer冲洗MS柱3次，每次500 μL。MS柱移出磁场，加1 mL Buffer，配备活塞加压快速推出滞留在MS柱内的标记细胞，离心管收集。对CD117+细胞进行活力测定并计数，留作流式纯度鉴定和共培养使用。

1.2.2.2FCM检测CD117+细胞纯度及CD117 CD34表达率 设置对照管、实验管1和2。对照管加MNCs悬液200 μL、IgG-APC和IgG-PE各5 μL，实验管1和2均加分选后的阳性细胞悬液200 μL和5 μL CD117-APC，实验管2再加CD34-PE 5 μL，混匀，4 ℃冰箱避光孵育30 min，PBS洗涤离心，加400 μL PBS重悬上机检测。

1.2.3MECs促进HSCs增殖

1.2.3.1HSCs培养基 添加有20% FBS、25 ng/mL SCF、25 ng/mL IL-3、0.1 mg/mL青霉素及链霉素的DMEM-F12完全培养基。

1.2.3.2分组 (1)对照组：HSCs单培养；(2)共培养组：HSCs+MECs。

1.2.3.3细胞准备 (1)MECs：“铺路石”的MECs经胰酶消化后，收集入离心管，PBS洗涤离心。MECs培养基重悬，密度为5.0×104个/mL。(2)HSCs：MACS收获的HSCs，PBS洗涤离心。HSCs培养基重悬，密度为5.0×104个/mL。

1.2.3.4种板与换液 (1)共培养组：MECs接种于24孔板，每孔200 μL，设3个复孔。37 ℃、5% CO2、95%湿度孵箱培养，细胞贴壁后去掉培养基每个复孔均加HSCs悬液200 μL、HSCs培养基300 μL，继续培养。(2)对照组：24孔板，每孔HSCs悬液200 μL、HSCs培养基300 μL，设3个复孔。37 ℃、5% CO2、95%湿度孵箱中培养。每3天半量换液，培养7 d。

1.2.3.5荧光显微镜观察 荧光显微镜下观察生长情况，每天取3个复孔悬浮细胞计数，计算扩增倍数。

1.2.3.6FCM检测共培养组扩增后CD117 CD34表达率 收集MECs组3个复孔HSCs，PBS洗涤离心，400 μL PBS重悬，一式两份，1份加IgG-APC、IgG-PE各5 μL，混匀，作同型对照；另1份加CD117-APC、CD34-PE各5 μL，混匀。4 ℃冰箱避光孵育30 min，PBS洗涤离心，400 μL PBS重悬上机检测。

2 结 果

2.1MECs分离、培养、鉴定

2.1.1MECs原代培养 接种后6 h见贴壁细胞，第3天细胞聚集生长，形成形态大小较一致的细胞簇，第6天相邻细胞突起彼此相连，成“血管样”改变，第14天达80%融合，呈“铺路石”外观，见图1。

2.1.2CD31免疫荧光鉴定 荧光显微镜下，细胞呈绿色，细胞核呈蓝色，见图2；培养第8天阳性细胞百分率为54.5%。

2.1.3MECs流式鉴定 vWF、CD31、CD34、CD45的阳性率分别为81.39%、45.80%、57.48%、0.17%，见图3。

2.2GFP小鼠骨髓HSCs分离、鉴定

2.2.1骨髓HSCs分离 骨髓经密度梯度离心后分4层，中间的云雾层即为MNCs。平均每只小鼠骨髓可获得约1.1×108个MNCs，活细胞率为98%。

2.2.2CD117+细胞回收及纯度 每只小鼠MNCs经MACS分选后可获约4.7×105个CD117+细胞，活细胞率为97%，纯度为99.51%，见图4。

图1 MECs原代培养(×40)

A：DAPI染色图；B：CD31抗体染色图；C：A、B合成图

图2 CD31抗体免疫荧光鉴定(×200)

图3 流式检测MECs 的vWF、CD31、CD34、CD45表达

图4 MACS分选后的CD117+细胞纯度分析

2.3MECs促HSCs增殖

2.3.1对照组和共培养组细胞扩增变化 共培养第0天，两组HSCs计数均为1.00×104个；共培养第7天，对照组、共培养组HSCs计数分别为6.92×104、12.31×104个，见表1。荧光显微镜下观察HSCs生长情况：共培养第2、4、6、7天，共培养组绿色荧光细胞多于对照组，见图5。第1～7天，共培养组与对照组细胞计数的相对变化倍数分别为1.21、1.35、1.50、1.72、1.71、1.75和1.78，两组细胞计数比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1；第4天变化最明显，见图6。对照组第1～7天较第0天的HSCs细胞计数比较：第1天扩增0.99倍(P>0.05)，第2～7天扩增倍数分别为1.42、2.30、4.25、5.66、6.45、6.92(P<0.05)。共培养组第1～7天较第0天的HSCs细胞计数比较：第1～7天扩增倍数分别为1.20、1.92、3.45、7.31、9.72、11.28、12.31(P<0.05)。

2.3.2共培养组共培养前后HSCs CD117 CD34共表达率变化 共培养前HSCs CD117 CD34共表达率为75.85%，见图7。共培养后HSCs CD117 CD34共表达率为92.06%，见图8。共培养7天后，共培养组HSCs CD117 CD34共表达率增加。

图5 荧光显微镜下观察HSCs生长情况(×100)

图6 共培养组与对照组HSCs细胞计数的相对变化

图7 共培养前HSCs D117 CD34共表达率流式检测

组别第0天第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天对照组 1.000.99±0.03 1.42±0.022.30±0.064.25±0.205.66±0.126.45±0.14 6.92±0.17共培养组 1.00 1.20±0.04* 1.92±0.45*3.45±0.09*7.31±0.06*9.72±0.12*11.28±0.12*12.31±0.11*

注：**P<0.05，与对照组比较

图8 共培养后HSCs CD117 CD34共表达率流式检测

3 讨 论

骨髓龛按照骨髓解剖部位和功能作用差异分为两类：以成骨细胞为主的成骨龛，以内皮细胞(endothelial cells，ECs)为主的血管龛[2]。前者维持HSCs的稳态，后者调控HSC增殖、分化、动员及归巢[3]。然而不同组织来源的ECs生物学特性存在差异。MECs存在于毛细血管、微静脉及微动脉，肺组织含量最多[4]，取材简便，因此作为本实验ECs来源。目前ECs鉴定方法主要有3种：细胞形态、细胞抗原标记、细胞器超微结构。W-P小体是代表性的ECs细胞器超微结构，但是该小体会因种属、部位、培养条件、细胞状态的差异而呈现不同的形状和结构，出现概率极低[5-7]。故本实验选用前两种方法鉴定ECs。CD31、CD34、vWF是ECs鉴定较为理想的抗原标记。本实验小鼠肺组织经Ⅰ型胶原酶消化的细胞在培养第6天细胞突起彼此相连，成血管样改变，第14天长至80%融合，呈“铺路石”样。培养第8天的细胞CD31荧光检测阳性率为54.5%。第14天细胞流式检测vWF、CD31、CD34、CD45的阳性率分别为81.39%、45.80%、57.48%、0.17%，符合文献报道[8]。故本实验成功培养出肺MECs。

HSCs主要存在于骨髓龛，目前骨髓分离HSCs的方法主要有免疫磁珠分选和流式细胞分选。免疫磁珠分选法操作简便、快速，MACs分离纯度高达99%，细胞损伤小，可直接用于培养研究和流式检测。CD117即SCF受体，主要表达于造血干/祖细胞。本实验选用CD117作为分选小鼠HSCs免疫标记。每只小鼠骨髓经CD117磁珠分选后可收获4.7×105个阳性细胞，纯度为99.51%，成功分选出骨髓HSCs。

共同起源学说认为血管ECs与早期HSCs都是由胚胎卵黄囊血岛细胞分化而来[9]。激活小鼠ECs中的蛋白激酶B1(AKT1)，不仅可以扩增HSCs，还能重建辐射小鼠的造血系统[10]。脑MECs通过胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)功能性克隆促进CD34+CD38-HSCs体外增殖[11]。MECs能促进损伤后HSCs的保持和更新[12]。ECs作为脐血细胞的滋养层，可明显增加扩增CD34+CD38-细胞数量[13]。综上研究，ECs会调控HSC增殖、分化、归巢。本研究发现共培养过程中：(1)培养时间增加，两组HSCs数量均增加，MECs组较对照组增加更明显。(2)第1～7天均与第0天对比，共培养组及对照组HSCs均扩增，且共培养组扩增倍数大于对照组，第4天MECs促进HSCs增殖的作用最明显。由此可见，MECs促进HSCs增殖，且第4天最明显。

综上所述，共培养第7天的共培养组悬浮细胞HSCs CD117 CD34共表达率增加，而既往研究发现小鼠年龄和状态会影响HSCs CD34抗原表达。5周龄以下的小鼠，包括胚胎期、新生小鼠，所有的HSCs都表达CD34，7周龄小鼠有CD34-的HSCs，10～20周龄大多数HSCs不表达CD34[14]。小鼠CD34+HSCs与CD34-HSCs可以相互转化，活化状态下的HSCs表达CD34[15]，人HSCs CD34抗原表达是可逆的[16]。4～6周龄小鼠HSCs分为CD34+和CD34-群[17]。笔者认为MECs可以促进HSCs CD34表达，但其具体机制需要进一步研究。

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