基于nrDNA ITS序列分析蒙山鹅耳枥与鹅耳枥亲缘关系

闵现东 ，高 远 ，钱长照 ，赵卫光 ，刘 建

（1.费县国有塔山林场，山东 费县 273400；2.山东省水土保持与环境保育重点实验室/临沂大学资源环境学院，山东 临沂 276005；3.临沂市科学探索实验室，山东 临沂 276037）

鹅耳枥属植物为第三纪始新世古老残遗种，在植物系统发育、古植物区系、濒危机制和生物多样性等方面有着较高研究价值[1-2]。陈贝贝等基于ITS序列曾分析了天台山4种鹅耳枥属植物的进化关系[3]，蒙山鹅耳枥(Carpinus Mengshanensis)是 1991 年梁书宾和赵法珠[4]发表的新种，已被《山东植物精要》和中国数字植物标本馆收录，但并未被中国植物志收录，

植物中nrDNA为高度重复串联序列，由于其转录间隔区ITS进化速度快且片段长度不大，以及协调进化的缘故，导致大多数物种中这些重复单元已发生纯合或接近纯合，在植物个体内和群体间均具有高度均质性，因此nrDNA ITS已被广泛用于被子植物科内以及属内、种内系统发育关系的研究[5-8]，将具有细胞核遗传特点的ITS序列用于鉴定植物物种是进化遗传学研究的热点之一[9-12]。本研究分析蒙山鹅耳枥和鹅耳枥(Carpinus turczaninowii)ITS序列，以期为蒙山鹅耳枥的鉴定以及与鹅耳枥的亲缘关系提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 样品

试验所用蒙山鹅耳枥和鹅耳枥的植物材料均取自蒙山，每种均选取5株独立植株，植株长势良好且无病虫害，植株间距约500 m，海拔高度约800 m，2015年10月选取新鲜枝叶封装后冷冻保存。

1.2 DNA提取

采用改良的CTAB法[13]从蒙山鹅耳枥和鹅耳枥的叶片中提取植物总DNA。

(1)首先选择有效的植物材料3 g，用液氮研磨成粉，将粉末转移至装有18 mL 65℃预热的2×CTAB缓冲液的50 mL离心管中，混匀。置于65℃水浴90分钟，期间不时摇动。

(2)取出离心管，冷却至室温后加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，轻轻震荡混匀至少 20分钟。室温离心6000 rpm，15分钟。

(3)将上层水相转移至另一个干净的50 mL离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)轻轻震荡混匀至少20分钟。室温离心6000 rpm，15分钟。

(4)同样将上层水相转移至另一个干净的50 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀。-20℃放置30分钟或更长时间，沉淀DNA。

(5)4℃离心6000 rpm，15分钟，小心倒掉上清液，不要把DNA沉淀倒出来。

(6)将DNA转移至1.5 mL的离心管中，用75%的乙醇洗涤重悬沉淀，4℃离心12000 rpm，2分钟，倒掉上清。重复2次。

(7)吸净乙醇后，室温晾干DNA沉淀。加入大约500 μL TE缓冲液，溶解 DNA。同时加入 5 μL RNase A，37℃消化RNA 15分钟。

(8)-20℃保存溶解后的DNA，备用。

1.3 PCR

1.3.1 引物设计ITS P1：5’-AACAAGGTTTCCGTAGGTGA-3’ITS P2：5’-TATGCTTAAATTCAGCGGGT-3’

1.3.2 PCR反应体系(50 μL)

ddH2O，32 μL；10×KOD buffer，5 μL；MgSO4(25 mM)，3 μL；dNTPs(2 mM)，5 μL；正向引物(10 μM)，1 μL；反 向引物(10 μM)，1 μL；KOD plus(5 U/μL)，1 μL；模板 DNA，2 μL

1.3.3 PCR反应程序

94℃，2 min；98℃，10 s；55℃，30 s；68℃，1 min；扩增循环数：32；68℃，10 min；4℃，保存。

1.3.4 DNA回收

(1)在紫外灯下，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，放进1.5 mL离心管，估算切下的凝胶块重量。

(2)加入3倍胶体积的DE-A溶液，混合后在75℃加热，每隔几分钟颠倒混匀，直到凝胶完全融化(约 10 min)。

(3)加0.5个DE-A溶液体积的DE-B溶液，混合均匀。

(4)吸取上一步中的混合溶液转移到DNA制备管中，12000 g离心1 min，弃滤液。

(5)将制备管放回2.0 mL离心管中，加500 μL W1溶液，12000 g离心1 min，弃滤液。

(6)将制备管放回2.0 mL离心管中，加700 μL W2溶液，12000 g离心1 min，弃滤液。重复1次。

(7)将制备管放回2.0 mL离心管中，12000 g离心1 min。

(8)将制备管放到新的1.5 mL离心管中，在制备膜上加30 μL ddH2O，室温静止1 min，12000 g离心1 min洗脱DNA。

1.4 测序

DNA片段回收以后直接送到Invitrogen公司测序，测序引物为：

1.5 主要仪器设备

NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher，USA)、C1000 Thermal Cycler 基因扩增仪 (BIO-RAD)、Sub-Cell GT cell核酸电泳槽 (BIO-RAD)、DYY-7C型稳压稳流电泳仪、Molecular Imager凝胶成像系统(BIO-RAD)、CENTRIFU GE 5810R高速冷冻离心机(Eppendorf)、CENTRIFU GE 5417R高速冷冻离心机(Eppendorf)，Thermo Scientific Legend Micro 17 微量台式离心机。

2 结果与分析

2.1 ITS序列

2.1.1 鹅耳枥ITS序列

2.1.2 蒙山鹅耳枥ITS序列

我们将采集的野外鹅耳枥与蒙山鹅耳枥样品通过DNA提取、PCR、DNA回收和DNA测序，实测鹅耳枥与蒙山鹅耳枥ITS序列均为601个碱基序列，两者间有1个碱基差别。

2.1.3 蒙山鹅耳枥ITS与NCBI数据库比对结果

我们将实测蒙山鹅耳枥ITS序列导入NCBI数据库，进行比对，结果显示蒙山鹅耳枥ITS序列与Carpinus sp.Wen 9187(编号 EJ011711729.1)序列相似度为100%，与同属近缘种鹅耳枥序列相似度为99%。

3 结论与讨论

本研究以采自蒙山的两种鹅耳枥属植物鹅耳枥和蒙山鹅耳枥为材料，克隆到了各自的ITS序列，尽管两种植物都来自5个不同样点，但每种植物来自各样点的ITS序列完全相同，这表明了同一物种在地理分布与亲缘关系的一致性。

鹅耳枥与蒙山鹅耳枥ITS测序结果显示，两物种ITS序列高度相似，601个碱基序列中只有1个碱基差别。将蒙山鹅耳枥ITS序列导入NCBI数据库，比对后发现，蒙山鹅耳枥ITS序列与Carpinus sp.Wen 9187(编号 EJ011711729.1)序列相似度为100%，与同属近缘种鹅耳枥序列相似度为99%。蒙山鹅耳枥是独立物种，建议《中国植物志》以及电子数据库承认其新种地位并进行收录。蒙山鹅耳枥的分布区[4,14]不仅限于蒙山，韩国也可见其分布，表明其不再属山东特有物种[15]。

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