Dectin⁃1介导人急性单核细胞白血病细胞巨噬细胞样细胞吞噬白念珠菌的作用研究

段志敏 杜蕾蕾 刘彩霞 曾荣 沈永年 胡素泉 刘维达 陈青 李岷

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所 江苏省皮肤性病分子生物学重点实验室（段志敏、李岷），中心实验室（杜蕾蕾），激光科（曾荣），真菌科（沈永年、胡素泉、刘维达）；南京医科大学附属南京市第一医院皮肤科（刘彩霞）；江苏省血液中心（陈青）

树突细胞相关C型凝集素1（Dectin⁃1）是一种重要的C型凝集素样受体，能够特异性识别β葡聚糖的模式识别受体（PRR），可在结合β葡聚糖后激活并诱导机体产生固有免疫反应和适应性免疫反应，包括介导吞噬、活化信号传导通路和转录因子，产生活性氧以及分泌细胞因子和趋化因子等［1⁃2］。已有研究证实，Dectin⁃1可介导白念珠菌与巨噬细胞的识别，进而导致机体抗白念珠菌的免疫反应［3］。人单核细胞白血病细胞（THP⁃1）来源于人原始单核细胞，常用来研究单核-巨噬细胞的功能、信号传导通路、代谢情况及吞噬活性等［4］，用丙二醇甲醚醋酸酯（propylene glycol monomethyl ether acetate，PMA）可诱导分化为成熟巨噬细胞［5］。本研究观察巨噬细胞吞噬白念珠菌情况，探讨Dectin⁃1受体对巨噬细胞吞噬白念珠菌的影响。

资料和方法

一、资料

1.细胞和菌株：THP⁃1购于美国模式培养物集存库（ATCC）。白念珠菌由中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心、中国医学科学院皮肤病研究所真菌科提供。

2.主要试剂：钙荧光白染料（CFW，美国Sigma⁃Aldrich公司）；二氢罗丹明（DHR123，德国Ruibio公司）；iTaq Universal SYBR Green Supermix（美国Bio⁃rad公司）；PrimeScript RT Master Mix反转录酶试剂盒（日本Takara公司）；抗人/灵长类Dectin⁃1 PE抗体（美国eBioscience公司）。

二、方法

1.细胞培养与siRNA转染：细胞制备成105/ml细胞悬液，接种于6孔（每孔2 ml）及12孔（每孔1 ml）细胞培养板，加入100 μg/L PMA刺激48 h后换液。针对Dectin⁃1基因，设计并合成特异性siRNA（上海吉玛制药技术有限公司，编号为CLEC7A⁃Homo⁃335）序列。正向引物：5′⁃GGGAAUCCUAUGCUUGG UATT⁃3′，反向引物5′⁃UACCAAGCAUAGGAUUCCC TT⁃3′。无义片段（NC）序列，正向引物：5′⁃UUCUCC GAACGUGUCACGUTT⁃3′，反向引物：5′⁃ACGUGAC ACGUUCGGAGAATT⁃3′。以 lipofectamine 2000 为载体转染入THP⁃1巨噬细胞样细胞。

2.菌株制备与染色：以血球计数板计数，最终配制成108CFU/ml菌悬液，置于水浴锅内56℃30 min灭活。灭活白念珠菌菌悬液以0.1 mg/ml CFW室温染色30 min，PBS洗涤，荧光显微镜下观察。CFW可与真菌细胞壁多糖成分结合，染色后真菌轮廓在紫外线下呈蓝色。白念珠菌孢子与DHR123（30μmol/L）于37℃孵育30 min，离心，PBS洗涤后热灭活，用于流式细胞仪检测吞噬率。CFW及DHR123为常用微生物染色剂，不影响微生物吞噬过程［6⁃7］。

3.实时荧光定量PCR法检测Dectin⁃1 mRNA表达：将转染siRNA 24 h的THP⁃1巨噬细胞样细胞以TRIzol法提取总RNA，按Prime Script RT Master Mix反转录酶试剂盒说明书将1 μg总RNA反转录为cDNA。使用ABI7300 PCR仪，采用SYBR Green法扩增目的基因。β肌动蛋白和Dectin⁃1引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。β肌动蛋白引物序列，正向5′⁃TCTGGCA CCACACCTTCTA⁃3′，反向5′⁃AGGCATACAGGGACA GCAC⁃3；Dectin⁃1引物序列，正向 5′⁃GGAAGCAAC ACATTGGAGAATGG⁃3，反向 5′⁃CTTTGGTAGGAGTC ACACTGTC⁃3′。反应条件：预变性95℃10 min，变性95℃15 s，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，循环数40。以β肌动蛋白为内参照，得到基因Ct值，结果按2⁃ΔΔCt计算，得到Dectin⁃1与β肌动蛋白基因相对量。实验重复3次。

4.流式细胞仪检测Dectin⁃1蛋白表达：转染siRNA 24 h THP⁃1巨噬细胞样细胞重悬于100 μl PBS中，每孔加入5 μl Dectin⁃1 PE流式抗体，4 ℃孵育30 min；以PBS洗涤2次，振荡混匀，悬浮在200 μl PBS中，流式细胞仪检测，每份样品收集10 000个细胞，通过FSC/SSC设门。采用Flow Jo软件进行分析，统计门内细胞平均荧光强度（MFI）。

5.siRNA干扰Dectin⁃1后THP⁃1巨噬细胞样细胞对白念珠菌吞噬检测：转染siRNA的THP⁃1巨噬细胞样细胞与CFW染色的白念珠菌以1∶10比例共培养1、2、4 h。用PBS洗2遍，荧光显微镜下观察、拍照。分别选择×40倍10个视野，计算吞噬率，吞噬率=吞噬白念珠菌的细胞数/总细胞数×100%；吞噬≥3个白念珠菌的细胞百分比=吞噬≥3个白念珠菌的细胞数/总细胞数×100%。将转染siRNA的THP⁃1巨噬细胞样细胞与DHR123标记白念珠菌以1∶10共培养30 min、1 h、2 h、4 h，用PBS洗涤2次，流式细胞仪检测吞噬情况。

6.统计学分析：应用SPSS19.0统计软件，计量资料以±s表示。不同处理间mRNA表达水平比较采用单因素方差分析，并采用LSD⁃t检验进行两两比较。采用FlowJo7.6.2软件分析细胞表面Dectin⁃1的MFI及吞噬后DHR123的MFI，以±s表示，用t检验进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、THP⁃1巨噬细胞样细胞转染siRNA⁃Dectin⁃1后Dectin⁃1 mRNA及蛋白表达

转染siRNA⁃Dectin⁃1后Dectin⁃1 mRNA相对表达量为0.26±0.02，和转染NC相比（1.0±0.02）差异有统计学意义（t=26.163，P＜0.001）。转染NC与siRNA⁃Dectin⁃1后，Dectin⁃1蛋白表达量（MFI）分别为38.44±0.43、20.34±0.34，差异有统计学意义（t=33.03，P＜0.001）。

表1 siRNA干扰Dectin⁃1对THP⁃1巨噬细胞样细胞吞噬白念珠菌的影响（±s）

表1 siRNA干扰Dectin⁃1对THP⁃1巨噬细胞样细胞吞噬白念珠菌的影响（±s）

注：n=3

组别 吞噬率（%）无义片段组siRNA⁃Dectin⁃1组t值P值刺激后1 h 22.1±0.2 17.5±0.1 23.95＜0.05刺激后2 h 24.3±0.2 18.6±0.2 20.66＜0.01刺激后4 h 59.1±0.3 39.2±0.2 54.08＜0.01吞噬≥3个菌的细胞百分比（%）刺激后1 h 4.7±0.1 2.2±0.1 15.01＜0.01刺激后2 h 5.4±0.2 2.5±0.1 17.30＜0.01刺激后4 h 8.3±0.4 5.1±0.2 24.40＜0.01

二、荧光显微镜下观察siRNA干扰Dectin⁃1对THP⁃1巨噬细胞样细胞吞噬白念珠菌的影响

THP⁃1巨噬细胞样细胞转染siRNA后与灭活白念珠菌共培养1、2、4 h后，吞噬率、吞噬≥3个菌细胞百分比明显降低（表1）。以预先用CFW染色后白念珠菌与THP⁃1巨噬细胞样细胞共培养，可见巨噬细胞将白念珠菌吞入胞内（图1）。

三、流式细胞仪检测siRNA干扰Dectin⁃1对THP⁃1巨噬细胞样细胞吞噬白念珠菌的影响

图1 荧光显微镜下无义片段组与白念珠菌培养2 h（×100） 可见白念珠菌（蓝色荧光）被THP⁃1巨噬细胞样细胞吞入胞内

图2 DHR123染色前后流式细胞仪检测白念珠菌孢子的荧光强度变化

表2 转染siRNA⁃Dectin⁃1后THP⁃1巨噬细胞样细胞吞噬白念珠菌的平均荧光强度（MFI）（±s）

表2 转染siRNA⁃Dectin⁃1后THP⁃1巨噬细胞样细胞吞噬白念珠菌的平均荧光强度（MFI）（±s）

注：n=3

组别无义片段组siRNA⁃Dectin⁃1组t值P值刺激后30 min 45.7±0.35 36.8±0.19 22.348＜0.05刺激后1 h 62.4±0.42 54.3±0.23 16.915＜0.05刺激后2 h 84.9±0.39 72.1±0.29 24.836＜0.05刺激后4 h 116.7±0.67 93.6±0.55 26.649＜0.05

DHR123染色白念珠菌后，90%孢子荧光阳性（图2）。转染siRNA⁃Dectin⁃1后THP⁃1巨噬细胞样细胞吞噬白念珠菌每组平均荧光强度与转染NC相比降低，P＜ 0.05（表2）。

讨 论

吞噬作用属于一种保守的固有免疫反应，对于病原微生物的杀伤、清除以及启动适应性免疫反应都具有重要作用。吞噬作用依赖于细胞表面吞噬相关受体，如Dectin⁃1受体、甘露糖受体（MR）、清道夫受体等；受体与配体结合并活化，介导吞噬反应。

机体对白念珠菌吞噬作用构成了抗白念珠菌感染第一道防线，目前已报道多种受体参与介导对白念珠菌的吞噬，如Dectin⁃1、MR、补体受体等［1］。Dectin⁃1受体作为一种重要的与β葡聚糖高亲和力结合的PRR，在抗白念珠菌感染方面作用突出，研究广泛。然而，既往研究多以单独白念珠菌细胞壁成分进行研究，不能准确反映出白念珠菌孢子刺激机体后出现的吞噬效应。本研究通过siRNA干扰Dectin⁃1受体表达，以荧光显微镜和流式细胞仪两种方法检测巨噬细胞在干扰Dectin⁃1受体表达前后对白念珠菌吞噬效应，从整体角度阐述Dectin⁃1受体在白念珠菌感染后的吞噬效应中所发挥的作用。

Dectin⁃1与β葡聚糖结合后，刺激信号通过Dectin⁃1的跨膜杆状结构使细胞质侧的ITAM磷酸化，再通过活化Dectin⁃1-脾脏酪氨酸激酶（Syk）-胱冬肽酶募集结构域9（CARD9）信号传导途径、丝氨酸-苏氨酸激酶-1（Raf⁃1）信号传导途径来诱导免疫反应［3⁃5］，产生一系列细胞因子、趋化因子［8］。同时作为一种吞噬受体，Dectin⁃1能介导巨噬细胞识别和吞噬酵母相的白念珠菌［4］。已有研究发现，阻断对β葡聚糖的吞噬作用会引起增强且持久的炎症反应，提示Dectin⁃1受体所介导的吞噬作用不仅在清除外来病原体方面起作用，而且可以调控β葡聚糖引起的下游炎症反应［8］。在本研究中，通过为THP⁃1巨噬细胞样细胞转染Dectin⁃1受体siRNA，经mRNA与蛋白水平验证，Dectin⁃1受体表达水平明显降低，证明转染成功。在干扰了Dectin⁃1受体表达后发现其对白念珠菌吞噬水平较转染无义片段组明显降低，提示Dectin⁃1受体在巨噬细胞吞噬白念珠菌的效应中发挥重要作用，降低Dectin⁃1水平的表达将减少对白念珠菌清除。

本研究结果显示，在明显降低Dectin⁃1受体表达水平后，巨噬细胞对白念珠菌仍有一定水平吞噬效应，且随着时间延长，吞噬效应逐渐增加，提示在减少或缺乏Dectin⁃1受体表达情况下，其他受体仍然可以介导对白念珠菌吞噬效应。已报道β葡聚糖可以直接活化补体旁路途径介导吞噬效应［9⁃10］；白念珠菌细胞壁的甘露聚糖成分可与MR结合并诱导激活发挥吞噬功能［11⁃12］，因此，巨噬细胞对白念珠菌吞噬作用与多个受体联合作用相关。通过提高Dectin⁃1活化水平，可能会提高对白念珠菌感染控制水平；从而为临床上抗白念珠菌感染提供新的防治思路。

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