肉色迷孔菌深层发酵培养条件的探究

张智超，路晓玉，孟青青，吴海英，周红昕

（吉林省生物研究所，吉林长春 130012）

1 肉色迷孔菌

肉色迷孔菌[Daedalea dickinsii(Berk. ex Cke.)Yasuda]，别名迪金斯栓菌、扁疣菌、肉色栓菌，属担子菌门层菌纲非褶菌目多孔菌科迷孔菌属，多分布在四川、云南、安徽、浙江、河南和吉林等地。子实体一年生，木栓质，无菌柄，侧生。菌盖（4～14）cm×（6～27）cm，厚1～2cm，基部厚达3cm，半圆形，扁平或稀马蹄形，表面有不明显的辐射状皱纹和环纹，或有小疣和小瘤，细绒毛，渐变光滑，初浅肉色，后变为棕灰色至深棕灰色，盖缘薄、钝、全缘，下侧无子实层。菌肉淡褐色、粉红色至肉桂色，具环纹，厚3～10mm，可达20mm。菌管同菌肉色，单层，长3～20mm，管口近似盖色，形状不整齐，边缘多为圆形，其他为多角形至长方形，每1～2个/mm，向边缘渐呈长方形至迷路状，偶尔出现近褶状。管壁厚，全缘。孢子无色、光滑，近球形，5～4μm，杨、栎、桦、胡桃等倒木、伐木桩上单生或覆瓦状叠生。引起多种阔叶树的木材及枕木等形成片状或块状褐色腐朽。

肉色迷孔菌子实体强大的药用价值体现在其实体热水提取物对氨水抑制率为41%，对小白鼠肉瘤180的抑制率达到80%，对艾氏癌的抑制率为100%。其主要作用为抑制基质金属蛋白酶活性，基质金属蛋白酶为癌细胞大量繁殖所必需激活的酶介质，故抑制基质金属蛋白酶就相当于抑制癌细胞的生长，人工合成金属蛋白酶抑制剂治疗癌症已取得初步成功。肉色迷孔菌水解产生的氨基酸与糖蛋白与已发现的基质蛋白酶组织抑制因子里面的TIMP-1结构相似，对新型药物-金属蛋白酶抑制剂的研究具有极大的推动作用。

研究资料表明，深层发酵后得到的菌丝体和野生子实体相近。（1）深层发酵后得到的菌丝体在营养价值方面高于子实体本身。如，荷叶离褶伞菌丝体蛋白质含量为28.3%，粗多糖为3.55%，氨基酸种类为18种，而野生子实体蛋白质含量为21.4%，粗多糖为1.77%，氨基酸种类为17种,其发酵产物营养成分高于野生子实体[1]。（2）在生理机能方面以灵芝为例，灵芝子实体纤维化、木质化程高，苦味浓，灵芝孢子细胞壁厚，不易被人体利用，而通过液体深层发酵生产灵芝菌丝体，产品苦味小，有效成分高于子实体，其菌丝体中的粗多糖及多糖含量是子实体的2.26倍和3.5倍[2]。所以，对于肉色迷孔菌这样的药用价值较高，子实体纤维化程度高的菌类扩繁采用深层发酵技术获得菌丝体的方法不但可以提高产物的产量，还可以弥补其子实体生理机能方面的缺点，还具有周期短、操作条件可控、降低菌体受到污染的可能性等方面的优点。另外，液体菌种深层发酵相对于人工栽培子实体而言，能够大大降低子实体在萌发过程中出现的重金属等土壤及病虫害带来的污染，从源头上减少产物中的杂质。也就是说，在药用菌子实体时，通常采用固体栽培的方式，利用木质、草质等原材料进行固体培养。但是，固体培养菌种生长周期长，栽培料袋灭菌率不易达到标准，这样的培养方式大大制约了食药用菌的发展。而采用液体深层发酵的方法来获得菌丝体的方式不受这些外在因素的影响，而且能够做到菌龄统一，杂质少，纯度高，操作简单，节约劳动力，缩短栽培时间，提高产量进而提升产物转化率。另外，液体深层发酵技术是现代化的生物技术，利用此技术可以以产物中获得更多的粗多糖、多糖、氨基酸等物质。

肉色迷孔菌深层发酵工艺，其发酵目的为获得肉色迷孔菌的菌丝多糖及胞外多糖。研究表明，肉色迷孔菌精制胞外多糖的抗氧化能力较好[3]，而且能够抑制基质金属蛋白酶的活性。众所周知，生物体自身在不断地产生一种叫自由基的物质，人体内如果存在活性较高的自由基便会对人类健康造成威胁。如果人的体内堆积了大量的自由基，就会造成蛋白质与DNA损伤、脂质过氧化作用等后果，进而使身体中的大部分细胞衰老、损伤、变异，引发各种疾病，免疫功能下降，包括癌症、心血管病和各种机能性病变。近年来人们发现的可消除自由基的真菌多糖的种类很多，肉色迷孔菌多糖为其中效果较好的一种。另外，肉色迷孔菌的胞外多糖的抗癌活性也十分强大。癌症是现今危害人类健康的主要疾病之一，肉色迷孔菌多糖抗癌活性主要是通过两种途径：（1）有效抑制肿瘤细胞产生的基质金属蛋白酶来控制癌症进程；（2）激活免疫细胞，增强机体抵抗癌细胞的能力，大大提高淋巴细胞、巨噬细胞及网状细胞的吞噬能力，从而使机体自身具有直接杀死或抑制癌细胞的增生的能力。基于肉色迷孔菌多糖的强大药用价值，研究肉色迷孔菌发酵工艺具有深远的意义。本文主要阐述肉色迷孔菌深层发酵条件的优化。

2 肉色迷孔菌深层发酵条件的优化试验

发酵工艺中，条件的优化是提高发酵液质量的一项重要技术手段。在发酵过程中，往往要根据目标产物的不同而制定不同的发酵工艺。控制发酵条件就是控制目标产物的收率，发酵工艺中的条件包括接种量、温度、摇床振荡速率和培养液装瓶量、pH值等。

本实验在前期工作基础上，利用摇瓶实验对培养条件进行优化。基础培养基为葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.1%。

2.1 培养温度的选择

在500mL三角瓶中装入150mL液体培养基，接种后分别在24、26、28、30℃和32℃5种不同温度的恒温摇床中进行培养，摇床速率为150r/min，获得生物量如图1所示。

培养温度可以直接影响整个发酵过程中各物质的反应速率及对氧的溶解度。菌体代谢过程、代谢产物的产生都与培养温度有着密切的关系，菌种不同其适宜的温度也不同，所以适宜的温度是液体发酵过程中必须考察的条件之一。

图1 温度对肉色迷孔菌菌丝生物量的影响

如图1所示，肉色迷孔菌在24～32℃均可生长，在30℃时发酵液中生物量最大，可达到0.48g，因而得出结论最适培养温度为30℃。

2.2 接种量的选择

分别用2%、4%、6%、8%、10%、12%的接种量将肉色迷孔菌菌种接到500mL三角瓶150mL液体基础培养基中，在恒温摇床30℃、150r/min的条件下进行培养，获得生物量如图2所示。

图2 接种量对肉色迷孔菌菌丝生物量的影响

接种量对液体发酵的影响里面有一点与装瓶量相同，就是接种量越大，溶氧量减少，进而影响发酵产物的合成。但接种量过小会延长发酵时间，降低发酵效率，易引起杂菌的生长。所以不同菌种接种量的大小一般取决于该菌种在发酵液中的繁殖速度。

如图2所示，肉色迷孔菌接种量的多少与发酵液中生物量有着密切的关系，明显看出随接种量的增加，菌丝生物量也呈现出增加的趋势，直到10%时获得最大生物量。由此得出结论，当接种量为10%时为最佳接种量。

2.3 转速的选择

将肉色迷孔菌菌种以10%的接种量接到500mL三角瓶150mL基础培养基上，置于不同转速的摇床上进行培养，培养温度为30℃，天数为6天，获得生物量如图3所示。

图3 摇床速率对肉色迷孔菌菌丝生物量的影响

调节摇床的振荡速率也是发酵工艺中的重要环节。提高摇床的振荡速率可提高培养液中氧的溶解速率，还可以打散菌种，这都是菌丝体生长所必需的。但如果摇床的振荡速率过高时，也可能破坏掉生长出来的菌丝体，所以摇床速率过高时反而不利于菌丝生长。

由图3可以看出，肉色迷孔菌菌丝生物量与摇床速率不呈递增的线性关系，当摇床速率为80r/min时发酵液中所获得的生物量最大。

2. 4 pH值的选择

将肉色迷孔菌菌种以10%的接种量接到500mL三角瓶150mL基础培养基中，将培养基pH值分别调成5、6、7、8，置于速率80r/min的摇床上进行培养，培养温度为30℃，天数为6天，获得生物量如图4所示。

图4 pH值对肉色迷孔菌菌丝生物量的影响

发酵液的pH值是发酵过程中各种生化反应的综合指标。了解菌丝体适合生长的pH环境可了解菌体的生长规律及代谢特征。

由图4可知，发酵液中pH值对肉色迷孔菌菌丝生物量影响较大，当pH超过6时菌丝生长速度明显下降，pH值为7～8时几乎不再生长。发酵液中pH值变化曲线对工业化生产发酵非常重要。

2.5 装瓶量的选择

将肉色迷孔菌菌种以10%的接种量接到500mL三角瓶，基础培养基装瓶量分别为20%、25%、30%、35%、40%和45%，置于速率80r/min的摇床上进行培养，培养温度为30℃，天数为6天，获得生物量如图5所示。

图5 装瓶量对肉色迷孔菌菌丝生物量的影响

发酵过程中，在摇床一定的转数的情况下，装瓶量越大，溶氧会越低，蒸发量也就越少，单位发酵液所分配的动力也会越少，所以不同的菌种所适宜的装瓶量会有所不同，但根据经验一般不会超过25%。

如图5所示，肉色迷孔菌菌丝生长的速度与培养基的装瓶量有关，当装瓶量为30%时菌丝的生物量最大，之后随着装瓶量的增大菌丝生物量逐渐减少，由此得出结论，培养基30%装瓶量为最佳。

3 结论

本实验通过从肉色迷孔菌子实体中分离纯化菌种，正交试验确定出液体深层发酵最适培养基的基础上，分别进行接种量、温度、pH、发酵液装瓶量、摇床转动速率的单因素试验，试验结果表明，肉色迷孔菌摇瓶液体培养的最适培养条件分别为接种量10%、温度30℃、pH值6、发酵液装瓶量150mL/500mL、摇床转速80r/min。

[1]席亚丽,王治江,王晓琴,等.荷叶离褶伞子实体、菌丝体和发酵液营养成分比较分析[J].食品科学,2010,31(6):155-157.

[2]赵翾.灵芝菌丝体液体深层发酵研究进展[J].食品研究与开发,2011,32(12):225-228.

[3]申进文,史超文,许春平.肉色迷孔菌胞外多糖的结构分析与抗氧化活性研究[J].河南农业大学学报,2013,47(5):596-599.