藏药悬钩木的质量标准研究

马志良　多杰

中圖分类号 R927 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）02-0179-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.02.09

摘 要 目的：建立藏药悬钩木的质量标准。方法：从性状特征、显微特征、薄层色谱（TLC）等方面对药材进行定性鉴别；测定药材水分、灰分、浸出物的含量。采用高效液相色谱法测定药材中芦丁和金丝桃苷的含量，色谱柱为Diamonsil C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（18 ∶ 82，V/V），流速为1.0 mL/min，检测波长为360 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。结果：药材表面呈灰红色至灰红褐色，有纵向皱沟，外皮易剥离，髓部较大、疏松、呈海绵状。药材粉末呈浅黄色，木纤维成束或单个散在，韧皮纤维较粗。药材样品中金丝桃苷的TLC图斑点清晰，分离度好；水分为6.71%～7.55%，总灰分为1.43%～1.67%，酸不溶性灰分为0.41%～0.48%，水浸出物为17.70%～19.31%，醇浸出物为13.76%～16.99%；金丝桃苷、芦丁检测质量浓度线性范围均为3.13～50 μg/mL（r分别为0.999 2、0.999 5）、定量限分别0.5、1.8 μg/mL，检测限分别为0.2、0.9 μg/mL，精密度、稳定性、重复性试验的RSD<2.0%（n=6），加样回收率分别为92.8%～98.8%（RSD=2.25%，n=9）、94.0%～98.6%（RSD=1.71%，n=9）。结论：药材水分、总灰分、酸不溶性灰分分别不得过10.0%、3.0%、0.6%；水浸出物、醇浸出物、芦丁和金丝桃苷总量分别不得少于15.0%、12.0%、1.0 mg/g。所建标准可用于藏药悬钩木的质量控制。

关键词 藏药；悬钩木；质量标准；芦丁；金丝桃苷；薄层色谱法；高效液相色谱法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the quality standard of Tibetan medicine Rubus biflorus. METHODS： The qualitative identification was conducted from characters characteristics， microscopic characteristics， TLC. The contents of moisture， ash and extract were determined. HPLC method was adopted for content determination of rutin and hyperoside. The determination was performed on Diamonsil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution（18 ∶ 82，V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 360 nm， column temperature was 30 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： The surface of the medicinal material was grayish red to grey red brown， with longitudinal wrinkle grooves， and the peel was easy to peel off. The pith of the medicinal material was large， loose， sponge-like. The powder of the medicine was light yellow； wood fiber was bundle or scattered individually； bast fiber was thick. TLC spot of hyperoside was clear and well-separated. The contents of moisture， total ash， acid-insoluble ash， water-soluble extract and ethanol extract were 6.71%-7.55%， 1.43%-1.67%， 0.41%-0.48%， 17.70%-19.31% and 13.76%-16.99%. The linear range was 3.13-50 μg/mL for rutin （r=0.999 2） and hyperoside （r=0.999 5）. The limits of quantitation were 0.5，1.8 μg/mL， and the limits of detection were 0.2，0.9 μg/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6）. The recoveries were 92.8%-98.8%（RSD=2.25%，n=9），94.0%-98.6%（RSD=1.71%，n=9） . CONCLUSIONS： The moisture content， total ash and acid insoluble ash content of medicinal materials is not more than 10.0%， 3.0% and 0.6%， respectively. The total amount of water extract， alcohol extract， rutin and hyperoside is not less than 15.0%， 12.0%， 1.0 mg/g， respectively. Established standard can be used for quality control of Tibetan medicine R. biflorus.

KEYWORDS Tibetan medicine； Rubus biflorus； Quality standard； Rutin； Hyperoside；TLC；HPLC

藏药悬钩木始载于《四部医典》，为藏医常用药材，藏文译音为“干扎嘎日”[1]，为蔷薇科悬钩子属植物粉枝莓（Rubus biflorus Buch.-Ham. ex Smith）的干燥去皮的茎或枝。其分布于我国陕西、甘肃、四川、青海、西藏等地，在印度西北部、克什米尔地区、巴基斯坦、阿富汗、伊朗等地也有分布[2]。《晶珠本草》记载：“悬钩木味甘、苦、微辛，果味甘、酸，用于治隆热病、培根病、浮肿，治肺病特效，亦治热性时疫[3]。”悬钩木药材被广泛用于藏药复方制剂中，如十一味能消散、四味土木香散等[1]，其化学成分主要包括槲皮素、木犀草素、芹菜素、山柰酚、矢车菊素及其糖苷类以及金丝桃苷、芦丁、粉枝莓素，二萜、三萜以及少数单萜，没食子鞣质、逆没食子鞣质、可水解鞣质低聚体和咖啡鞣质等[4-5]。现代药理研究表明，悬钩木具有活血化癖、清热解毒之功效[6-8]。本研究结合2015年版《中国药典》（一部）规定，从性状特征、显微特征、薄层色谱（TLC）等方面对悬钩木药材进行定性鉴别，测定药材水分、灰分、浸出物的含量，采用高效液相色谱法（HPLC）测定药材中芦丁和金丝桃苷的含量，从而建立一个相对完善的质量标准，为保障该药材质量提供一定依据。

1 材料

1.1 仪器

2695型HPLC仪，包括二元梯度泵、2996紫外检测器、Empower色谱工作站（美国Waters公司）；UPT-Ⅱ型超纯水机（成都优普超纯水科技有限公司）。

1.2 试剂

芦丁对照品（批号：100080-201610，纯度：>98%）、金丝桃苷对照品（批号：111521-201507，纯度：>98%）均购自中国食品药品检定研究院；硅胶薄层板（青岛海洋化工厂）；乙腈为色谱纯，甲醇为色谱纯和优级纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 药材

悬钩木药材采集自青海、甘肃和西藏等地（见表1），经中国科学院新疆理化技术研究所多杰教授鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 性状

药材样品呈圆柱形，长约 20 cm，直径 0.4～0.8 cm。表面灰红色至灰红褐色，有纵向皱沟、突起的侧枝痕及白色的皮刺基。外皮易剥离，剥离后呈红褐色。易折断，断面不平坦，皮部较薄、呈红褐色，木部黄白色至浅红褐色。髓部较大，疏松呈海绵状，呈白色至黄白色，体轻，质坚硬。气微，味淡。

2.2 显微鉴别

药材样品粉末呈浅黄色。木纤维成束或单个散在，壁较薄，壁孔不明显，木射线宽1～3列细胞，射线细胞类方形，壁孔及纹孔明显。韧皮纤维较粗，两端稍钝，胞腔较大。木栓细胞类方形或长方形，黄棕色。草酸钙簇晶较多，棱角圆钝或稍尖，大小不等。具缘纹孔导管较大，纹孔较密。显微特征详见图1。

2.3 TLC鉴别

取药材样品粉末（过2号筛）1.0 g，加甲醇20 mL，加热回流60 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取金丝桃苷对照品适量，加甲醇制成金丝桃苷质量浓度为2 mg/mL的对照品溶液。按2015年版《中国药典》（四部）TLC法[9]试验，吸取上述2种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V）为展开剂，避光展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝溶液，晾干，置日光灯下检视。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，详见图2。

2.4 水分测定

取10批药材样品粉末（过2号筛）适量，精密称定，按照2015年版《中国药典》（一部）附录ⅨH水分测定法的第一法（烘干法）[10]测定其中水分，每批平行测定3份。结果显示，药材样品水分为6.71%～7.55%，平均值为7.13%，详见表2。初步拟定悬钩木药材水分不得过10.0%。

2.5 灰分测定

取10批药材样品粉末（过2号筛）适量，精密称定，按照2015年版《中国药典》（一部）附录ⅨK灰分测定法[10]测定其中灰分。每批平行测定3份。结果显示，药材样品总灰分为1.43%～1.67%，平均值为1.58%；酸不溶性灰分为0.41%～0.48%，平均值为0.45%，详见表2。初步拟定悬钩木药材总灰分不得过3.0%，酸不溶性灰分不得过0.6%。

2.6 浸出物测定

取10批药材样品粉末（过2号筛）适量，精密称定，按照2015年版《中国药典》（一部）附录ⅩA浸出物测定法[10]测定其中水浸出物和醇浸出物（乙醇体积分数为95%），每批平行测定3份。结果显示，药材样品水浸出物为17.70%～19.31%，平均值为18.40%；醇浸出物为13.76%～16.99%，平均值为15.50%，详见表2。初步拟定悬钩木药材水浸出物不得少于15.0%，醇浸出物不得少于12.0%。

2.7 含量测定

2.7.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（18 ∶ 82，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL[11]。在上述色谱条件下，理论板数以芦丁和金丝桃苷峰计均不低于5 000；各成分基线分离良好，分离度大于1.5，详见图3。

2.7.2 混合对照品溶液的制備 精密称取芦丁、金丝桃苷对照品各5.0 mg，置于同一100 mL量瓶中，加乙腈溶解并定容，摇匀，得芦丁、金丝桃苷质量浓度均为0.05 mg/mL的混合对照品溶液。

2.7.3 供试品溶液的制备 取药材样品粉末（过2号筛）0.500 g，置于100 mL回流圆底烧瓶中，加乙腈25 mL，密塞，称定质量，70 ℃回流2 h；放冷至室温，再次称定质量，用乙腈补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.7.4 线性关系考察 分别精密量取“2.7.2”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释为原溶液质量浓度的1/2、1/4、1/8、1/16，制成系列混合对照品溶液。精密量取上述混合对照品原溶液和系列稀释溶液各10 μL，按“2.7.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以芦丁、金丝桃苷质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得芦丁、金丝桃苷回归方程分别为y=147 120x+27 634（r=0.999 2）、y=227 953x-1 338 091（r=0.999 5）。结果表明，芦丁、金丝桃苷检测质量浓度线性范围均为3.13～50 μg/mL。

2.7.5 定量限与检测限考察 分别精密量取“2.7.2”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，并按“2.7.1”项下色谱条件进样测定。当信噪比为10 ∶ 1时，得定量限；当信噪比为3 ∶ 1时，得检测限。结果，芦丁、金丝桃苷的定量限分别为0.5、1.8 μg/mL，检测限分别为0.2、0.9 μg/mL。

2.7.6 精密度试验 取“2.7.2”项下混合对照品溶液适量，按“2.7.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，芦丁、金丝桃苷峰面积的RSD分别为0.79%、0.12%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7.7 稳定性试验 取“2.7.3”项下供试品溶液（编号：XGM-1）适量，分别于室温下放置0、4、8、12、24 h时按“2.7.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，芦丁、金丝桃苷峰面积的RSD分别为1.01%、1.72%（n=6），表明供试品溶液室温放置24 h内基本稳定。

2.7.8 重复性试验 精密称取样品（编号：XGM-1）适量，按“2.7.3”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.7.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，芦丁、金丝桃苷含量平均值分别为0.930、0.280 mg/g，RSD分别为1.94%、1.06%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.7.9 加样回收率试验 取已知含量样品（编号：XGM-1）适量，共9份，分别加入高、中、低质量的待测成分对照品，按“2.7.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.7.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

2.7.10 药材样品含量测定 取10批药材样品各适量，分别按“2.7.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.7.1”項下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果显示，药材样品中芦丁和金丝桃苷总量为1.103～1.331 mg/g，平均值为1.203 mg/g，详见表2。初步拟定两者总量不得少于1.0 mg/g。

3 讨论

笔者研究了藏药悬钩木药材原标准中的性状和显微特征，增加了TLC鉴别，水分、灰分、浸出物与芦丁、金丝桃苷的含量测定。在TLC预试验中，笔者考察了不同展开系统，并考察了不同点样量（1、2、3、4 μL）对展开结果的影响，发现以乙酸乙酯-甲酸-水（8 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V）为展开剂、点样2 μL时，斑点清晰，效果最佳；另外，还考察了不同温度、湿度、薄层板对展开结果的影响，发现各条件对展开结果影响不大。

笔者对收集的10批悬钩木药材样品进行了测定，结果水分为6.71%～7.55%，总灰分为1.43%～1.67%，酸不溶性灰分为0.41%～0.48%，水浸出物为17.70%～19.31%，醇浸出物为13.76%～16.99%，因此，暂定水分、总灰分、酸不溶性灰分分别不得过10.0%、3.0%、0.6%，水和醇浸出物分别不得少于15.0%、12.0%。研究发现，不同产地悬钩木药材中芦丁和金丝桃苷含量略有差异，结合药材来源、存放等原因，为保证其临床疗效，暂定芦丁和金丝桃苷总量不得少于1.0 mg/g。

综上所述，所建立的标准可用于藏药悬钩木的质量控制。

参考文献

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（收稿日期：2017-04-21 修回日期：2017-07-03）

（编辑：张 静）