广西巴马小型猪SP1基因克隆测序及其真核表达载体的构建

张广杰 崔悦悦 邱庆庆 夏琴 李龙 司景磊 夏攀杰 邹辉 兰干球

摘要：【目的】克隆广西巴马小型猪特异性蛋白1（SP1）基因，并构建其真核表达载体，为揭示其对猪生长发育的调控机理打下基础。【方法】利用RT-PCR从广西巴马小型猪背最长肌组织中扩增SP1基因，采用DNASTAR、TMHMM等分别进行基因生物信息学分析；以pEGFP-N1质粒构建真核表达载体pEGFP-N1-SP1并转染293T细胞，于转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察并拍照。【结果】克隆获得的广西巴马小型猪SP1基因与GenBank中野猪（Sus scrofa）的参考序列（XM_005652569.3）一致，未发现碱基突变位点；其编码序列（CDS）全长2340 bp，编码779个氨基酸。广西巴马小型猪SP1蛋白不存在跨膜结构，也不存在信号肽，不属于分泌型蛋白；其二级结构中α-螺旋占17.84%，延伸链占21.31%，β-转角占9.76%，无规则卷曲占51.09%。构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能成功转染至293T细胞中并表达出绿色荧光蛋白。【结论】广西巴马小型猪SP1基因CDS序列编码蛋白主要参与细胞内活动，而非外分泌型蛋白，以SP1基因构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能转染293T细胞并成功表达，可直接用于后期SP1基因功能探索及干扰表达等研究。

关键词： 广西巴马小型猪；SP1基因；克隆；真核表达载体；生物学信息分析

中图分类号： S828.89 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）02-0360-07

0 引言

【研究意义】特异性蛋白1（Specificity protein 1，SP1）于1983年首次被发现，与之后相继发现的8种同类蛋白共同组成SP样转录因子家族（SP1～SP9）。SP家族蛋白参与细胞增殖分化、细胞凋亡、胚胎发育、肿瘤形成等多种生命过程，是一类功能非常广泛的转录因子（潘奇等，2007；王丽杰等，2008；熊琪等，2012；苗露，2014）。SP1是众多基因的基本转录因子，参与多种基因的转录调控，近年来有关SP1促进动物生产方面的研究越来越受到重视，因此，克隆SP1基因并进行生物信息学分析，对揭示SP1转录因子对动物基因的转录调控机理具有重要意义。【前人研究进展】目前，有关SP1转录因子的研究主要集中在肿瘤、癌症等方面。Jungert等（2007）在胰腺癌细胞迁移试验中发现，SP1是TGF-β调控上皮细胞向间质细胞转换的关键影响因子，其功能主要通过波形蛋白的转录诱导来介导。Grande等（2012）通过胚胎癌细胞对顺铂试验，发现SP1转录因子控制凋亡蛋白NOXA的表达。Luster等（2015）研究证实，破坏SP1位点可降低成纤维生长因子（FGF-4）基因在胚胎癌细胞中的表达量。林冬静和何倩丽（2016）研究表明，SP1主要通过TGF-β、ERK、PI3K/Akt和Wnt/β-catenin等信号通路发挥作用，促进肿瘤细胞生长。Chen等（2017）研究发现，敲除SP1能显著减弱TGF-β诱导PC3和HepG2细胞中NKG2DL上调表达，即SP1在TGF-β诱导的NKG2DL上调表达过程中发挥重要作用。Deng等（2017）研究发现，通过上调SP1基因表达，能促进结肠、直肠癌细胞的迁移和侵袭。Ye等（2017）也研究发现，SP1参与胃癌细胞中SHIP2基因的表达，SHIP2蛋白在受体内吞降解过程中发挥重要作用，即SP1是肿瘤形成过程中的一个重要蛋白，降低其转录活性有助于降低癌细胞SHIP2基因的表达量。有关SP1在动物生产方面的研究，熊琪等（2012）研究表明，SP1转录因子表达抑制致使成肌细胞中SKIP启动子活性显著下降，即SP1可能通过顺式作用元件GC-Box对成肌细胞分化过程中SKIP基因的转录激活起正向调控作用；郝光（2014）研究表明，SP1 mRNA在草鱼的肠和鳃中表达最高，出膜前的表达量明显高于出膜后，并证实适量外源谷氨酰胺二肽对草鱼肠道中的SP1 mRNA表达起促进作用；李朋辉（2014）研究发现，SP1是猪肝羧酸酯酶基因（PLE1）转录的强激活因子，其单独作用可有效上调该基因启动子的活性；李龙等（2017）研究证实，SP1对广西巴马小型猪肉质性状相关基因ANK1启动子具有明显的促进转录作用。【本研究切入点】至今，有关SP1调控猪生长方面的研究甚少，在广西巴马小型猪方面的研究则鲜见报道。【拟解决的关键问题】以广西巴马小型猪为研究对象，克隆SP1基因并构建其真核表达载体，利用在线生物信息学分析软件对SP1基因序列进行生物学信息分析，为揭示其对猪生长发育的调控机理打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

广西巴马小型猪肌肉组织（背最长肌）、转染的293T细胞和pEGFP-N1质粒由广西大学动物科学技术学院动物遗传育种实验室保存提供。大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，RNAiso Plus及反转录试剂盒6210A、高保真PCR扩增试剂盒、pMD18-T载体、Xho I和Kpn I快切酶购自TaKaRa公司，琼脂糖凝胶购自Biowest公司，质粒小提制备试剂盒购自GENEray公司，SanPrep柱式DNA膠回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，T4连接酶购自Promega公司，去内毒提质粒试剂盒购自OMEGA公司，细胞培养基购自Gibco公司，胎牛血清和转染试剂盒购自LIFE公司，胰蛋白酶购自Hyclone公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 引物设计 通过NCBI网站的GenBank获得猪SP1基因mRNA（XM_005652569.3）编码序列（CDS），利用Oligo 7.0设计两对引物（表1）。其中，SP1-F/SP1-R引物对用于扩增SP1基因；SP1-F-Xho I/SP1-R-Kpn I引物对在SP1-F/SP1-R引物两端加上相应的酶切位点（下划线部分），用于扩增含酶切位点的目的片段及双酶切鉴定。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 2 总RNA提取及检测 按照RNAiso Plus使用说明提取廣西巴马小型猪背最长肌组织总RNA，并利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。

1. 2. 3 RT-PCR扩增 根据反转录试剂盒6210A使用说明反转录合成cDNA，然后进行PCR扩增，其反应体系20.00 μL：Taq Mix 10.00 μL、SP1-F/SP1-R各1.00 μL、cDNA 2.00 μL、ddH2O 6.00 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 150 s，进行35个循环；72 ℃延伸5 min。经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒使用说明回收PCR产物。

1. 2. 4 挑取单克隆菌落 将获得的PCR产物与pMD18-T载体进行连接过夜，然后转化DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄霉素（AMP+）的LA培养基上，37 ℃倒置培养12 h后挑取阳性单一菌落，经含氨苄霉素的LA培养基扩大培养4 h，挑选阳性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1. 2. 5 生物信息学分析 测序结果使用DNASTAR进行比对分析，利用MegAlign构建系统发育进化树，通过ProtScale和TMHMM对SP1氨基酸序列的亲/疏水性及跨膜结构进行预测分析，并以SOPMA对SP1蛋白的二级结构进行预测分析。

1. 2. 6 增加酶切位点及构建真核表达载体 对测序结果正确的菌液进行质粒提取，将提取的阳性质粒再次进行PCR扩增，扩增引物为SP1-F-Xho I/SP1-R-Kpn I。获得的PCR产物与pMD18-T载体连接，挑取回收阳性重组质粒pMD18-T-SP1-Xho I/Kpn I，然后将其与pEGFP-N1质粒同时进行Ank I和Xho I双酶切，双酶切结束后用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，分别切取回收目的条带和断裂的pEGFP-N1质粒条带进行回收。将两段PCR回收产物进行T4连接，然后转化DH5α感受态细胞，取转化菌液200.0 μL均匀涂抹于含卡那霉素（KAN+）的LA培养基上，37 ℃倒置培养15 h，然后挑斑扩大培养4 h，挑取阳性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果正确的阳性菌液按去内毒提质粒试剂盒使用说明进行阳性菌落扩大培养及去内毒提质粒操作，以获得真核表达载体pEGFP-N1-SP1。

1. 2. 7 细胞转染 采用293T细胞进行转染，以10%胎牛血清+90% DMEM培养基在直径60 mm的培养皿中培养，待细胞生长至占培养皿底面积70%～80%时将细胞转移至6孔平板中继续培养。待6孔平板中的细胞生长至占所在孔底面积50%时进行换液，当细胞生长至占所在孔底面积60%～70%时进行转染。按照转染试剂盒使用说明进行操作，即每孔细胞加入真核表达载体1.0 μg、OPTI-MEM? 500.00 μL、Plus Reagent 1.00 μL和LTX Reagent 2.00 μL。转染48 h后进行观察拍照。

2 结果与分析

2. 1 总RNA提取效果

以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的提取效果，结果（图1）观察到3条完整的条带（28S、18S和5S），说明总RNA提取效果良好。

2. 2 RT-PCR扩增结果

以广西巴马小型猪肌肉组织总RNA为模板进行RT-PCR扩增，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，在2400 bp附近出现单一明亮的目的条带（图2），与预期结果相符。阳性克隆菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，结果表明，广西巴马小型猪SP1基因CDS序列与GenBank中已发表的对应碱基序列一致，表明成功克隆获得广西巴马小型猪SP1基因序列。

2. 3 广西巴马小型猪SP1基因序列对比分析结果

经DNASTAR比对分析发现，广西巴马小型猪SP1基因与GenBank中野猪（Sus scrofa）的XM_005652569.3序列完全一致（图3），未发现碱基突变位点，其CDS序列全长2340 bp，编码779个氨基酸。基于SP1基因序列，利用MegAlign构建系统发育进化树，结果显示，广西巴马小型猪与野猪的亲缘关系最近，先聚为一个分支（图4），再与人类（Homo sapiens）和犬（Canis lupus familiaris）聚为一支；而与牛（Bos taurus）、山羊（Capra hircus）、猴（Macaca mulatta）和鼠（Rattus noregicus）的亲缘关系较远。

2. 4 广西巴马小型猪SP1蛋白生物信息学分析结果

利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）对广西巴马小型猪SP1蛋白的跨膜结构进行预测，结果发现其不存在跨膜结构（图5）。利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对SP1蛋白进行信号肽预测，结果（图6）表明，广西巴马小型猪SP1蛋白不存在信号肽，不属于分泌型蛋白。利用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）对SP1蛋白进行亲/疏水性预测，结果（图7）显示，广西巴马小型猪SP1蛋白N端有12个疏水性氨基酸，其后多为亲水性氨基酸；C端多为疏水性氨基酸，偶有亲水性氨基酸。其最大疏水值为1.978，位于第58位氨基酸处，最小疏水值为-3.200，分别位于第381和382位氨基酸处。以SOPMA（http：//npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred-sopam.pl/）对广西巴马小型猪SP1蛋白二级结构进行预测分析，结果（图8）表明，有139个氨基酸构成α-螺旋，占氨基酸总数的17.84%；166个氨基酸构成延伸链，占氨基酸总数的21.31%；76个氨基酸构成β-转角，占氨基酸总数的9.76%；398个氨基酸构成无规则卷曲，占氨基酸总数的51.09%。

2. 5 真核表达载体pEGFP-N1-SP1的鉴定结果

構建的重组质粒pMD18-T-SP1-Xho I/Kpn I经Xho I和 Kpn I双酶切鉴定，结果获得大小分别为2800 bp的pMD18-T载体条带和2400 bp左右的目的条带（图9），与预期结果相符，表明在目的片段两端已成功加入酶切位点。对构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1进行PCR验证和双酶切鉴定，其电泳结果显示在2400 bp附近均出现单一明亮的目的条带（图10），表明真核表达载体pEGFP-N1-SP1中含有正确的广西巴马小型猪SP1基因序列。

2. 6 293T细胞转染效果

相同条件下，分别以真核表达载体pEGFP-N1-SP1和pEGFP-N1质粒转染293T细胞，转染48 h后于倒置荧光显微镜下进行观察，结果发现经pEGFP-N1-SP1和pEGFP-N1转染的293T细胞均可观察到绿色荧光（图11），但pEGFP-N1的转染效果（荧光量及荧光强度）优于pEGFP-N1-SP1，空白对照组未观察到荧光，表明真核表达载体pEGFP-N1-SP1成功转染至293T细胞中并表达出绿色荧光蛋白，进一步佐证真核表达载体pEGFP-N1-SP1构建成功。

3 讨论

目前，国内外关于SP1的研究主要集中在肿瘤细胞产生和细胞凋亡方面。已有大量研究表明，在肿瘤发生时期SP1的表达水平较正常情况存在明显差异，对肿瘤的发生可能起决定性作用（Black et al.，2001），在临床医学诊断方面已将SP1等转录因子作为肿瘤发生的一种示病症状予以利用（王丽杰等，2008）。由于SP1对细胞的增殖分化及基因转录方面具有重要调节作用，因此可利用插入或敲除SP1基因的方法上调或下调动物生产相关基因表达，其在动物生产方面的研究潜力非常巨大。熊琪等（2012）研究表明，利用RNA干扰技术抑制SP1基因表达，能有效促使猪成肌细胞中SKIP启动子活性显著下降，说明SP1转录因子对成肌细胞分化过程中SKIP基因的转录激活起正向调控作用。Zhang等（2016）研究表明，SP1通过结合到ROCK1启动子区域而正向调节猪ROCK1基因转录，并影响其造血过程。

本研究成功克隆获得广西巴马小型猪SP1基因，将其CDS序列克隆至pEGFP-N1质粒中构建了真核表达载体pEGFP-N1-SP1，通过转染293T细胞发现真核表达载体pEGFP-N1-SP1可成功转染293T细胞并表达出绿色荧光蛋白，即可直接用于后期SP1基因功能探索及干扰表达等研究，节省反复构建载体的时间。测序结果表明，广西巴马小型猪SP1基因CDS序列全长2340 bp，编码779个氨基酸，与野猪的亲缘关系最近；其编码SP1蛋白不存在跨膜结构，也不存在信号肽，即SP1蛋白不属于外分泌型蛋白，主要参与细胞内活动，与苗露（2014）的研究结果一致。广西巴马小型猪SP1蛋白二级结构预测结果显示，以无规则卷曲为主要结构元件，占51.09%，推测这些复杂氨基酸位点与其功能实现密切相关，但具体原理有待进一步探究。

4 结论

广西巴马小型猪SP1基因CDS序列与野猪的参考序列一致，其编码蛋白主要参与细胞内活动，而非外分泌型蛋白，以SP1基因构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能转染293T细胞并成功表达，可直接用于后期SP1基因功能探索及干扰表达等研究。

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（責任编辑 兰宗宝）