丁酸梭菌对断奶仔猪生长性能、肠道结构和免疫功能的影响

郑有秀　王　超　邹晓庭　王　丽　卢建军*

(1.浙江大学动物科学学院，浙江省饲料与动物营养重点实验室，农业部(华东)动物营养与饲料重点实验室，浙江大学动物分子营养学教育部重点实验室，杭州 310058；2.南京农业大学动物科技学院，南京 210095；3.湖北绿雪生物产业有限公司，咸宁 437110)

断奶是养猪生产中的一个必经环节。断奶过程中，仔猪面临营养、生理、环境、微生物和免疫应激[1]，发生肠道功能障碍，出现采食量降低和腹泻等症状[2]，小肠绒毛萎缩，影响营养物质的消化和吸收[3]。研究表明，仔猪饲粮中添加抗生素能在一定程度上缓解断奶应激[4]，但长期使用抗生素会对生态环境、畜禽甚至人类健康造成一定的负面影响[5-6]。益生菌是近年出现的新型饲料添加剂，能抑制病原菌的黏附和生长繁殖，保持动物胃肠道的微生态平衡，其代谢产生的益生物质可作为宿主的营养来源或帮助动物消化吸收。由于益生菌具有安全、高效、无污染等优点，其已经逐步应用于医疗、保健、食品、畜牧和水产等行业[7]。

丁酸梭菌又名酪酸梭菌，是一种益生菌活菌制剂，为革兰氏阳性厌氧菌，具有芽孢结构，能够耐受饲料加工过程中的高温、高压环境[8]，对人工胃液、肠液和胆盐也有较强耐受性[9]。丁酸梭菌是人和动物肠道中的正常菌群，能产生短链脂肪酸、氨基酸、酶等多种益生物质，具有促生长和增强机体免疫力等功能，其主要代谢产物——丁酸还可作为肠道上皮组织细胞再生和修复的营养物质[10]。基于丁酸梭菌的益生生理功能和作为饲料添加剂的可行性，其受到研究人员和养殖从业者的广泛关注，并作为一种新型饲料添加剂逐步应用于畜禽生产中，用以提高畜禽的生产性能，改善机体肠道环境，维持肠道结构和增强机体免疫功能[11-13]。近年来也有丁酸梭菌应用于养猪业的报道，但其作用效果不一[14-16]，作用机理尚不明确，需要进一步研究。本试验通过在饲粮中添加不同水平的丁酸梭菌，研究其对断奶仔猪生长性能、肠道结构和免疫功能的影响，为丁酸梭菌在生产中的实际应用提供依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

丁酸梭菌由湖北绿雪生物产业有限公司提供，活菌数为2.0×108CFU/g。

1.2　试验设计

选取(25±1)日龄、体重(6.24±0.32) kg的健康“杜×长×大”杂交仔猪360头，随机分为5个组，每组4个重复，每个重复18头猪。对照组饲喂不添加丁酸梭菌的玉米-豆粕型基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加250、500、1 000和2 000 mg/kg丁酸梭菌的试验饲粮。基础饲粮参照NRC(2012)营养需要，按照嘉豪农业有限公司保育前期料配方配制，其组成及营养水平见表1。各组饲粮均为粉料。试验期30 d。

表1　基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)

续表1项目 Items含量 Content营养水平 Nutrient levels2)消化能 DE/(MJ/kg)14.35粗蛋白质 CP20.30钙 Ca0.86总磷 TP0.63有效磷 AP 0.33赖氨酸 Lys1.28蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.83苏氨酸 Thr0.88

1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of the diet: VA 8 000 IU，VB14 mg，VB23.6 mg，VB540 mg，VB64 mg，VB120.02 mg，VD33 000 IU，VE 20 IU，VK32 mg，生物素 biotin 0.15 mg，叶酸 folic acid 1.0 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 11 mg，烟酸 nicotinic acid 10 mg，抗氧化剂 antioxidant 100 mg，Cu (as copper sulfate) 10 mg，Fe (as ferrous sulfate) 80 mg，Mn (as manganese sulfate) 30 mg，Zn (as zinc sulfate) 75 mg，I (as potassium iodide) 0.40 mg，Se (as sodium selenite) 0.30 mg。

2)消化能和有效磷为计算值，其余为实测值。DE and AP were calculated values, while the others were measured values.

1.3　饲养管理

试验在浙江省杭州市萧山区嘉豪农业有限公司保育舍进行，采用漏缝地板保育设备饲养。试验各组各重复置于同一保育舍不同保育栏，使不同组别仔猪的饲养环境差别最小。每天07:00、14:00和21:00喂料，喂料量以料槽中有少量剩余料为宜，全期自由采食与饮水，预防免疫和饲养管理按常规方法进行。

试验结束当天禁食12 h，充足饮水。按照每个重复至少随机选取1头的原则，各组随机选取6头仔猪，总计30头仔猪，称量宰前活重后颈动脉放血致死，采集血液、分离十二指肠、空肠、回肠、肝脏和脾脏组织。

1.4　检测指标与方法

1.4.1生长性能

试验开始和结束当天以重复为单位，对试验猪空腹称重，计算平均日增重(average daily gain，ADG)；每天记录各重复的采食量，计算平均日采食量(average daily intake，ADFI)和料重比(feed to gain ratio，F/G)；每天观察各重复仔猪的腹泻情况，计算腹泻率(diarrhea rate)；试验结束时统计各重复仔猪的死亡数，计算死淘率(mortality)。

F/G=全期饲粮消耗量(kg)/
全期仔猪增重(kg)；
腹泻率(%)=[试验期内腹泻仔猪头数/
(试验仔猪头数×试验天数)]×100；
死淘率(%)=(试验期内死淘仔猪头数/
试验仔猪头数)×100。

1.4.2肠道结构

取十二指肠、空肠、回肠中段约1 cm的肠段，在0.9% NaCl溶液中轻轻漂洗，去除肠道内容物后置于4%多聚甲醛中固定48 h以上，经过冲水、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，5 μm厚度连续切片，常规苏木精-伊红(HE)染色，脱水透明，固封。Nikon eclipse 80i共聚焦荧光显微镜观察，NIS-Elements BR 3.2系统拍照、采集并测量图片，每个切片选择10个左右相邻的肠绒毛和隐窝测量绒毛高度和隐窝深度，计算绒毛高度/隐窝深度。

1.4.3免疫功能

屠宰后分离出肝脏和脾脏进行称重，计算免疫器官指数。

免疫器官指数(g/kg)=免疫器官鲜重(g)/
宰前活重(kg)。

采集血液，静置，待血清析出后取上清液，3 500 r/min离心15 min，吸取上清液分装，置于-80 ℃冰箱保存。采用试剂盒测定血清补体3(C3)、补体4(C4)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量。试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.5　数据统计分析

试验数据用Excel 2003进行初步整理，采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，试验数据用“平均值±标准差”表示，各组间采用Turkey多重比较法进行差异显著性检验，以P<0.05为差异显著。

2　结　果

2.1　丁酸梭菌对断奶仔猪生长性能的影响

由表2可知，饲粮添加丁酸梭菌对断奶仔猪的ADG和F/G无显著影响(P>0.05)；250和1 000 mg/kg丁酸梭菌添加组的ADFI显著低于对照组(P<0.05)；250和500 mg/kg丁酸梭菌添加组的腹泻率较对照组分别显著降低了40.99%和44.32%(P<0.05)。由图1可知，饲粮添加250、500和2 000 mg/kg丁酸梭菌，仔猪的死淘率分别降低了67.11%、49.94%和17.77%，但差异均未达到显著水平(P>0.05)。

表2　丁酸梭菌对断奶仔猪生长性能的影响

同行数据肩标相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，相邻字母表示差异显著(P<0.05)，相间字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with the adjacent letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with alternate letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

2.2　丁酸梭菌对断奶仔猪肠道结构的影响

由表3可知，饲粮添加丁酸梭菌对断奶仔猪十二指肠和回肠的绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度以及空肠和回肠的隐窝深度均无显著影响(P>0.05)。丁酸梭菌添加组的空肠绒毛高度较对照组分别显著提高了32.23%、35.71%、33.59%和47.36%(P<0.05)，空肠绒毛高度/隐窝深度较对照组分别显著或极显著提高了47.24%(P<0.01)、48.03%(P<0.01)、19.69%(P<0.05)和22.83%(P<0.05)。500 mg/kg丁酸梭菌添加组的十二指肠隐窝深度显著低于250和2 000 mg/kg丁酸梭菌添加组(P<0.05)。

数据柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。图2同。

Value columns with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant differences (P>0.05). The same as Fig.2.

图1丁酸梭菌对断奶仔猪死淘率的影响

Fig.1Effects ofClostridiumbutyricumon mortality of weaned piglets

2.3　丁酸梭菌对断奶仔猪免疫功能的影响

所屠宰断奶仔猪的免疫器官均无异常。由图2可知，各组断奶仔猪的肝脏指数和脾脏指数均无显著差异(P>0.05)。由表4可知，丁酸梭菌添加组断奶仔猪的血清IgA含量较对照组分别显著提高了112.11%、112.32%、165.55%和139.67%(P<0.05)，血清IgG含量较对照组分别显著提高了61.27%、46.43%、59.59%和43.33%(P<0.05)。各组的血清IgM、C3和C4含量无显著差异(P>0.05)。

3　讨　论

3.1　丁酸梭菌对断奶仔猪生长性能的影响

丁酸梭菌代谢可产生淀粉酶、维生素和氨基酸等物质，促进机体对脂肪和蛋白质的消化吸收[17]。本研究结果显示，饲粮添加丁酸梭菌有提高ADG、降低F/G的趋势，与庞敏等[15]的研究结果相一致。但也有研究发现，饲粮添加丁酸梭菌可显著提高断奶仔猪的ADG[14,18]。不同的研究试验结果不一致，可能是因为丁酸梭菌的产品质量、添加的剂量和时间、试验时间长短和试验动物日龄等不同。在本试验条件下，与对照组相比，250 mg/kg丁酸梭菌添加组仔猪的ADG无显著变化，ADFI却显著降低，F/G降低了12.78%，提示丁酸梭菌能提高营养物质的消化吸收，提高生长性能。与250和500 mg/kg丁酸梭菌添加组相比，1 000和2 000 mg/kg丁酸梭菌添加组断奶仔猪的生长性能无显著差异，可能是因为丁酸梭菌与肠道有益菌竞争营养物质和定植位点，导致可供机体利用的营养物质减少，不利于维持肠道微生态平衡。

表3　丁酸梭菌对断奶仔猪肠道结构的影响

图2　丁酸梭菌对断奶仔猪免疫器官指数的影响

表4　丁酸梭菌对断奶仔猪血清免疫指标的影响

断奶仔猪受到营养、心理和环境等因素的影响产生应激，表现出消化不良、腹泻、生长发育迟缓、抗病力较弱等症状，严重时可能死亡[19]。丁酸梭菌可通过刺激黏膜免疫[20]，提高机体的免疫力和抗病力，拮抗动物病原菌，维持和调节肠道微生态平衡[21]，有效缓解仔猪腹泻。本试验结果验证了上述观点，饲粮添加丁酸梭菌显著降低断奶仔猪的腹泻率，与肖雪梅等[16]的研究结果一致。肖克权等[22]研究发现，饲粮添加丁酸梭菌能改善麻鸡的生长性能，降低死淘率，本试验也得出相似的结论。

3.2　丁酸梭菌对断奶仔猪肠道结构的影响

断奶应激会造成肠道损伤，表现为肠道绒毛高度降低，隐窝加深，肠道形态由浓密、手指状绒毛群变为平滑、舌头状绒毛面，小肠主动吸收能力降低等[23]。庞敏等[15]研究发现，饲粮添加500 mg/kg丁酸梭菌能显著降低断奶仔猪的回肠隐窝深度，提高绒毛高度/隐窝深度。本试验结果显示，饲粮添加丁酸梭菌能显著提高断奶仔猪的空肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度，可能是因为丁酸梭菌代谢产生的丁酸可作为肠道上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质，对肠道上皮组织的再生和修复有促进作用[6]。丁酸梭菌是人和动物肠道的正常菌群，饲粮添加丁酸梭菌还可改善因断奶引起的肠道菌群失衡，缓解不良环境对肠道结构修复造成的压力。

3.3　丁酸梭菌对断奶仔猪免疫功能的影响

陈振等[24]在断奶仔猪饲粮中添加复合益生菌(含丁酸梭菌)，发现可显著提高仔猪的肝脏指数和脾脏指数。邓裴月[25]研究发现，饲粮单独添加丁酸梭菌或谷氨酰胺对断奶仔猪的肝脏指数和脾脏指数均无显著影响；而当丁酸梭菌与谷氨酰胺复合饲喂时，仔猪的肝脏指数和脾脏指数显著高于对照组。本试验结果显示，丁酸梭菌对断奶仔猪的肝脏指数和脾脏指数无显著影响，说明丁酸梭菌对断奶仔猪肝脏和脾脏的影响较小或无影响。

免疫球蛋白是介导体液免疫反应的主要抗体，能与特异性抗原相结合引起免疫反应，进而发挥保护机体的作用，其含量的升高提示机体免疫力提高。王腾浩[26]研究发现，饲粮添加丁酸梭菌ZJU-1具有提高断奶仔猪血清IgG、IgM和C4含量的趋势，可显著提高血清IgA和C3含量。本试验结果与该研究结果相似，与对照组相比，饲粮添加丁酸梭菌能显著提高血清IgA和IgG含量。结果提示，饲粮添加丁酸梭菌可能是通过刺激IgA和IgG的分泌来提高机体免疫功能。

4　结　论

① 饲粮添加适宜水平的丁酸梭菌可降低断奶仔猪的腹泻率，改善肠道结构。

② 饲粮添加适宜水平的丁酸梭菌可刺激机体分泌IgA和IgG，增强机体的免疫功能。

③ 综合各项指标，25～55日龄断奶仔猪饲粮丁酸梭菌的添加水平以250～500 mg/kg为宜。