ADAR2在妊娠期糖尿病产妇胎盘中的表达及干预机制

(开封市妇幼保健院，河南 开封 475002)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)指妊娠期间发生或者首次发生的不同程度的葡萄糖不耐受，但不排除妊娠前存在糖代谢异常的可能[1,2]。妊娠期糖尿病导致胎儿呼吸窘迫综合征症和巨大胎儿等并发症增加，其治疗先以运动饮食为主，如控制严重不佳再给予胰岛素干预。MTNR1A等不同基因多态性与GDM发病相关[3]。该病发病机理未阐明，DNA和RNA编辑修复功能基因多态性与其有一定相关性。本研究旨在通过检测妊娠期糖尿病和正常产妇胎盘中ADAR2的表达情况，并分析运动饮食治疗和胰岛素治疗的胎盘表达ADAR2是否有明显差异，报告如下。

1 资料与方法

1.1 免疫组化

收集妊娠糖尿病产妇的胎盘组织，按照传统方式进行组织石蜡切片制作，脱蜡后复染色。ADAR2表达以细胞质内出现棕黄色颗粒为判定阳性细胞的标准，随机选取5个400倍视野观察记录。评分标准0为阴性，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.2 光学显微镜和透射电镜观察细胞形态

通过倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态学变化并照相。收集培养的细胞用4℃预冷的2%戊二醛固定2 h，再用0.1M二甲砷酸钠缓冲液换液三次，每次2 h。之后用1%锇酸4℃固定2 h，用0.1M二甲砷酸钠缓冲液换液二次，每次15 min。接着梯度酒精脱水，环氧丙烷渗透，包埋，制备超薄切片，透射电镜观察细胞超微结构。

1.3 Western bolt

利用RIPA Buffer 裂解液提取各组细胞总蛋白，取20μL各组已处理的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳并在恒流200 mA，冰水浴条件下电转60 min转移至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭液完全封闭1 h，以封闭液按1∶1 000稀释乙抗体，将上述PVDF膜浸泡其中孵育3 h后，用TBST溶液洗膜，然后与1∶8 000稀释的二抗孵育1 h后利用ECL试剂盒化学发光显色。

1.4 实时荧光定量PCR 法检测

Trizol法提取SKOV-3和SKOV-3-Taxol细胞总RNA， RT-PCR 试剂盒逆转录制备cDNA，进行PCR扩增。 2-△△CT法计算mRNA的相对表达量，以GAPDH作为内参. 每个实验组重复3次。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0 进行数据分析，不同组间实验数据的比较均采用单因素方差分析，两组间的比较采用 LSD-t 检验，检验水准 α= 0.05。

2 结果

2.1 免疫组化检测妊娠糖尿病产妇胎盘的ADAR2表达

妊娠期糖尿病(A组)和妊娠期非糖尿病(B组)中ADAR2阳性表达率分别为92.7%(38/41)和84.6%(33/39)。如图1AB分别表示A组的低倍镜(x100)和高倍镜(x400)表达均高于B组(图C、D)。其中，A组中ADAR2阴性3例，弱阳性5例，阳性17例和强阳性19例；B组中ADAR2阴性6例，弱阳性18例，阳性11例和强阳性6例。

2.2 电镜下检测妊娠糖尿病产妇胎盘的ADAR2表达

透射电镜下观察滋养层细胞和细胞中，妊娠期糖尿病组的胎盘中，结果发现对照组中ADAR2定位于细胞膜、微绒毛和部分细胞浆内(图2A，x10 000)。微绒毛内ADAR2表达强阳性(图2B，x15 000)。运动和饮食治疗妊娠期糖尿病组的胎盘中，ADAR2主要定位于微绒毛、细胞膜和细胞浆中，弱阳性表达(图2C，x12 000)。微绒毛内ADAR2表达弱阳性(图2D，x25 000)。胰岛素治疗妊娠期糖尿病组的胎盘中，ADAR2主要定位于微绒毛、细胞膜和细胞浆中，弱阳性表达(图2E，x8 000)。微绒毛内ADAR2表达弱阳性(图2F，x15 000)。

图1 妊娠糖尿病和正常产妇胎盘中ADAR2的表达

图2 电镜下妊娠糖尿病和正常产妇胎盘中ADAR2的表达

2.3 Western Blot和PCR检测妊娠糖尿病产妇胎盘的ADAR2表达

与B组相比，A组胎盘中ADAR2 mRNA相对水平明显上升(2.47±0.15对比1.83±0.13,P<0.05)，其中运动饮食治疗C组和胰岛素治疗D组的ADAR2 mRNA相对水平明显低于A组，分别为(1.89±0.13)和(1.73±0.04)。见图3a和3b。

2.4 Western Blot检测产妇胎盘的ADAR2蛋白表达

Western Blot检测ADAR2 蛋白表达结果显示与B组相比，A组胎盘中ADAR2 蛋白明显上升(2.51±0.15对比1.81±0.10,P<0.05)，其中运动饮食治疗C组和胰岛素治疗D组的ADAR2 mRNA明显低于A组，分别为(1.82±0.05)和(1.79±0.05)。见图3c和3d。

图3 妊娠糖尿病和正常产妇胎盘中ADAR2的mRNA和蛋白表达

3 讨论

妊娠期糖尿病是困扰妊娠妇女的常见问题，导致胎儿呼吸窘迫综合征和巨大胎儿等并发症发生率明显增加。不同基因多态性与GDM发病相关，主要相关基因包括MTNR1B、TCF7L2和IRS1等，基因多态性发生率显著高于妊娠期非糖尿病产妇，且亚洲人群的TCF7L2和PPARG基因多态性与妊娠期糖尿病存在一定相关性，但在高加索人群未发现类似结果[4，5]。

RNA编辑是转录后mRNA和tRNA碱基变化现象，RNA编辑酶ADAR2是ADAR家族中关键酶，编辑底物主要是谷氨酸受体等[3]。本研究结果显示ADAR2在妊娠期糖尿病A组胎盘表达阳性率较高。与妊娠期非糖尿病B组相比，妊娠期糖尿病A组胎盘中ADAR2 mRNA明显上升，其中运动饮食治疗C组和胰岛素治疗D组的ADAR2 mRNA明显低于妊娠期糖尿病组。关于ADAR2基因调控葡萄糖代谢的研究较少，其血糖调控机制失调可能是胰岛细胞和胎盘细胞中ADAR2表达上升造成，与JNK磷酸化水平上升相关。在本研究中，后续检测ADAR2蛋白表达，其变化与mRNA变化结果相似，进一步证实胎盘ADAR2的表达失调与血糖调节失调相关。通过运动饮食治疗组和胰岛素治疗，均能改善患者的血糖失调严重程度，可能与降低ADAR2表达存在显著关系。目前胰岛素与ADAR2表达相关报道不多。Yang等证实ADAR2在胰腺细胞中参与调节糖代谢，且与神经递质受体和离子通道功能相关。在基因沉默ADAR2的胰腺细胞中结果显示ADAR2的基因沉默显著影响葡萄糖刺激的胰岛素分泌，并且显著降低氯化钾刺激的胰岛素分泌[5]。ADAR2定位于胰岛内分泌细胞，在胰岛素抵抗的小鼠胰腺组织中可见长期喂养高脂肪饮食的ADAR2表达翻倍，同时高脂肪饮食可诱导代谢应激，在胰岛细胞中明显增强RNA的转录编码离子型谷氨酸受体亚单位。此外，在空腹能量不足时，ADAR2蛋白表达受到抑制，但在给小鼠喂养后可完全可逆转ADAR2的低表达情况。

ADAR2与II型糖尿病基因多态性存在一定相关性，主要表现在亚洲印度人群中。且ADAR2可以结合dsRNA通过碱基碱基相互作用编辑RNA，其底物主要是以谷氨酸受体为主，与GluA2相关，介导疼痛中ADAR2表达及作用。

总之，ADAR2表达在妊娠期糖尿病产妇的胎盘中高表达，运动饮食干预和胰岛素治疗可下调其ADAR2表达水平，提示ADAR2可能是妊娠期糖尿病治疗的潜在靶点，为临床上妊娠期糖尿病饮食指导和胰岛素治疗提供理论依据。