响应曲面法优化钩藤叶中钩藤碱和异钩藤碱的提取条件

徐佳瑜，王晓红，杨胜伟，吕 享，张智仙，张明生

（贵州大学 生命科学学院/国家喀斯特石漠化防治工程技术研究中心/山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025）

钩 藤Uncaria rhynchophylla (Miq.) Miq. ex Havil.为茜草科Rubiaceae钩藤属Uncaria多年生木质藤本植物[1]，主要分布于广东、广西、四川、江西等地，其性微寒，味甘[2]。钩藤中含有多种生物碱[3-6]，其中钩藤碱和异钩藤碱具有清热平肝、息风定惊、降血压、抗惊厥等功效[7-9]，近年来受到广泛关注。目前对钩藤的研究主要集中在带钩茎枝，在中药中也常以钩藤带钩的干燥茎枝入药，叶则弃之不用。然而，已有研究报道钩藤叶中也含有钩藤碱和异钩藤碱等重要活性成分[10-12]，这说明钩藤叶亦可作为药用资源加以利用。为此，本试验以钩藤叶为试验材料，选择干燥温度、超声提取时间和提取剂浓度3个因素，利用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken效应面法将各因素与响应值之间的函数关系进行多样性拟合，通过对回归方程及响应面的分析[13-15]，优化钩藤碱和异钩藤碱的提取条件，并结合高效液相色谱法（HPLC）测定钩藤碱和异钩藤碱的含量[16-17]。本研究旨在为钩藤资源的充分利用提供理论和方法上的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

甲醇（色谱纯，美国TEDIA）；氨水（分析纯，成都金山化学药品有限公司）；钩藤碱和异钩藤碱对照品，质量分数≥98%（中国食品药品检定研究院，钩藤碱批号:11927-201403，异钩藤批号:112028-261601）；娃哈哈纯净水。

钩藤Uncaria rhynchophylla (Miq.) Miq. ex Havil.由昌昊金煌（贵州）中药有限公司提供，经贵州大学生命科学学院熊源新教授鉴定。试验时，先将钩藤的叶和钩茎置于恒温鼓风干燥箱中烘干至恒重，打粉，过20～40目筛，备用。

1.2 仪 器

Agilent 1260型HPLC仪（Agilent科技有限公司）；电子分析天平（上海菁海仪器有限公司）；JP-040S超声波清洗机（深圳市结盟清洗设备有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵（上海锦赋实验仪器设备有限公司）；UPT-II-20L超纯水系统（成都优普电子产品有限公司）；GZX-914MBE电热恒温鼓风干燥机（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）等实验室常用仪器。

1.3 HPLC测定钩藤碱和异钩藤碱含量[17-18]

1.3.1 色谱条件

色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相:甲醇 -0.1% 氨水（70∶30，V/V）等度洗脱；流速:1.0 mL·min-1；柱温:30 ℃；检测波长:245 nm；进样量:10 μL。

1.3.2 钩藤叶中钩藤碱和异钩藤碱提取液制备

精密称取钩藤叶粉末1.0 g于100 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL甲醇溶液，混匀后浸泡60 min，称重，放入4 ℃冰箱过夜，超声（频率为40 KHz），甲醇补足重量，摇匀，静置，取上清液用0.22 μm微孔有机滤膜过滤2次，作为供试品溶液。

1.3.3 标准品溶液制备

精密称取钩藤碱标准品5.00 mg和异钩藤碱标准品5.25 mg，分别置于25 mL的容量瓶中，加入70%甲醇溶液溶解并定容至刻度线，制成浓度分别为0.20 mg·mL-1钩藤碱标准品储备液和0.21 mg·mL-1异钩藤碱标准品储备液。

1.3.4 标准曲线的绘制

精密吸取 0.20 mg·mL-1钩藤碱和 0.21 mg·mL-1异钩藤碱标准品储备液各0.1、0.25、0.5、1、2、4、6、8 mL分别置于10 mL容量瓶中，分别用70%甲醇定容至刻度线，混匀。按“1.3.1”色谱条件进行测定，以标准品质量浓度（μg·mL-1）为横坐标（X），峰面积（mAU·s）为纵坐标（Y），分别绘制钩藤碱和异钩藤碱的标准曲线。

1.4 单因素试验

超声提取法提取钩藤叶中的钩藤碱和异钩藤碱，按照“1.3.2”项的方法制备钩藤碱和异钩藤碱的供试液，以“1.3.1”项条件下进行含量测定。试验中，将材料干燥温度、超声提取时间及甲醇浓度作为影响因素，固定其中2个因素，对另一因素进行单一因素试验，以提取率为评价指标。

1.5 响应曲面试验设计

在单因素试验的基础上，根据单因素试验结果，采用Box-Behnken模型，对试验进行设计，考察3个因素对提取效果的影响。

为保障被选派人员自身利益，河北省图书馆承诺被选派人员原有工资、津贴福利待遇标准不变，服务项目和培养任务结束后，对考核合格及优秀人员进行总结表彰。选派工作经历视同到艰苦地区工作经历，符合规定条件的，在工资、职务(职称)晋升、计算基层工作经历等方面，按现有倾斜政策执行。职称申报评审、岗位聘用时，同等条件下优先考虑选派人员。

1.6 样品测定

分别精密称取同一批次钩藤叶与钩茎粉末1.0 g于100 mL具塞锥形瓶中，按“1.3.2”项下的方法制备叶与钩茎的钩藤碱与异钩藤碱的供试液，以“1.3.1”项下的方法进行含量测定。重复3次。

2 结果与分析

2.1 线性关系

以标准品质量浓度（μg·mL-1）为横坐标（X），峰面积（mAU·s）为纵坐标（Y），做回归方程:钩藤碱的标准曲线回归方程为Y1=25.869X+18.754，R2=0.999 8；异钩藤碱的标准曲线回归方程为Y2=25.486X+32.270，R2=0.999 5。钩藤碱浓度在2～160 μg·mL-1范围内、异钩藤碱浓度在2.1～ 168.0 μg·mL-1范围内的线性关系较好。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 干燥温度对提取率的影响

加入70%甲醇、超声处理60 min，考查材料干燥温度分别为45、50、55、60、65℃处理时对钩藤碱和异钩藤碱提取率的影响。结果钩藤碱的提取率分别为100.81、118.29、142.25、129.79、114.00 μg·g-1，异钩藤碱的提取率分别为 346.88、376.60、426.86、403.25、322.53 μg·g-1（ 图 1）。随着对钩藤叶干燥温度的升高，钩藤碱和异钩藤碱的提取率逐渐升高，当干燥温度为55℃时，钩藤碱和异钩藤碱的提取率达到最高，随后均逐渐降低。可能是由于高温下钩藤碱和异钩藤碱不稳定，使其部分降解，从而导致提取率逐渐降低。

图1 干燥温度对钩藤碱和异钩藤碱提取率的影响Fig. 1 Effects of drying temperature on extraction yield of rhynchophylline and isorhynchophylline

2.2.2 提取剂浓度对提取率的影响

在50 ℃下干燥材料、超声处理60 min，考查甲醇的浓度分别为60%、65%、70%、75%、80%提取时对钩藤碱和异钩藤碱提取率的影响。结果钩藤碱的提取率分别为79.73、81.14、90.25、72.99、49.14 μg·g-1，异钩藤碱的提取率分别为304.88、294.50、313.41、311.76、283.43 μg·g-1（图2）。随着甲醇浓度的增加，钩藤碱的提取率逐渐升高，异钩藤碱的提取率先下降后逐渐升高，当甲醇浓度为70%时，此时钩藤碱和异钩藤碱的溶出量达到最大，钩藤碱和异钩藤碱的提取率达到最高。

图2 甲醇浓度对钩藤碱和异钩藤碱提取率的影响Fig. 2 Effects of methanol concentration on extractionyield of rhynchophylline and isorhynchophylline

2.2.3 超声提取时间对提取率的影响

在50 ℃下干燥材料、加入70%的甲醇，考查超声处理时间分别为30、40、50、60、70 min时对钩藤碱和异钩藤碱提取率的影响。结果钩藤碱的提取率分别为 86.33、89.34、102.10、99.04、92.51 μg·g-1，异钩藤碱的提取率分别为 307.91、304.35、318.04、312.43、298.50 μg·g-1（ 图 3）。随着超声处理时间的增加，钩藤碱的提取率逐渐升高，异钩藤碱的提取率先下降后逐渐升高；当超声处理50 min时，钩藤碱和异钩藤碱的提取率都达到最高，当继续超声提取时，可能由于仪器长时间工作产生的热能使提取温度缓慢升高，导致钩藤碱和异钩藤碱发生了降解或是异构化。

图3 超声提取时间对钩藤碱和异钩藤碱提取率的影响Fig. 3 Effects of ultrasound time on extraction yield of rhynchophylline and isorhynchophylline

2.3 响应曲面法优化试验结果

根据单因素试验的结果，采用Box-Behnken模型，将甲醇浓度（A）、超声提取时间（B）和材料干燥温度（C）作为考查因素，设置3因素3水平试验，每个水平用代码-1、0、+1表示，共组合成17组试验。试验因素与水平见表1，试验设计与结果见表2。

表1 因素与水平Table 1 Factors and levels

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken test design

运用Design-expert 8.0.6软件对试验结果进行多元回归拟合分析，得到钩藤碱提取率的二次多项回归模型为:D1=127.58+2.63A+5.31B-0.73C-1.58AB+0.51AC+2.22BC-1.71A2+0.53B2-12.68C2；异钩藤碱提取率的二次多项回归模型为:D2=411.95+8.37A+22.78B+3.89C-7.51AB-1.88AC-12.08BC+3.02A2-5.48B2-51.04C2。

由表3可知，钩藤碱提取的回归模型F值=21.27，P值=0.000 3＜0.001，表明二元多次回归模型极显著；失拟F值=2.02，失拟项P值=0.253 4＞0.05，模拟失拟不显著；校准系数R2=0.964 7，R2adj=0.919 4＞0.8，CV%=1.9，说明此模型能解释96.47%的响应值变化，该模型拟合程度较好。方差分析表明，模型中一次项超声时间（B）极显著，甲醇浓度（A）显著，烘干温度（C）不显著，影响顺序B＞A＞C；二次项C2极显著，A2、B2不显著；因素间交互作用均不显著。试验因素间交互作用的三维空间图见图4～图6。

表3 钩藤碱回归方程的方差分析†Table 3 Variance analysis for the created regression model of rhynchophylline

由表4可知，异钩藤碱提取的回归模型F值=26.20，P值=0.000 1＜0.001，表明二元多次回归模型极其显著；失拟F值=4.86，失拟项P值= 0.080 4＞0.05，模拟失拟不显著；校准系数R2=0.9712，R2adj=0.934 7，CV%=2.19，说明此模型能解释97.12%的响应值变化，该模型拟合程度较好。方差分析表明，模型中一次项超声时间（B）极显著，甲醇浓度（A）显著，烘干温度（C）不显著，影响顺序B＞A＞C；二次项C2极显著，A2、B2不显著；从交互项作用来看，超声提取时间和材料烘干温度间的交互作用提取效果显著。试验因素间交互作用的三维空间图见图7～图9。

表4 异钩藤碱回归方程的方差分析表Table 4 Analysis of variances for the created regression model of isorhynchophylline

图4 甲醇浓度和超声提取时间交互作用对钩藤碱提取率影响的响应面Fig. 4 Response surface curve of the interaction between methanol concentration and ultrasound time to rhynchophylline

图5 甲醇浓度和干燥温度交互作用对钩藤碱提取率影响的响应面Fig. 5 Response surface curve of the interaction between methanol concentration and drying temperature to rhynchophylline

选取交互作用影响显著的响应面曲面（图7）进行分析，当烘干温度不变时，异钩藤碱的提取率随着超声时间的增加而逐渐升高，在超声时间在60 min时达到最大，说明超声时间越长提取率越高；当超声时间不变时，随着干燥温度的逐渐升高，异钩藤碱的提取率在55 ℃时达到最大，当干燥温度进一步升高，提取率逐渐降低，说明高温不利于对异钩藤碱的提取。

2.4 验证试验

根据方程拟合出的最佳提取条件为:当叶片烘干温度54.95 ℃时，甲醇浓度73.35%和超声时间60 min，钩藤碱的理论预测提取率为 133.34 μg·g-1，异钩藤碱的理论预测提取率为429.75 μg·g-1。对理论值进行校正，烘干温度55 ℃，甲醇浓度73%，超声提取60 min，重复试验3次，实际测得钩藤碱提取率的平均值为130.80 μg·g-1，异钩藤碱提取率的平均值为425.60 μg·g-1，与理论值较吻合，说明该模型可以较好的优化钩藤叶中钩藤碱与异钩藤碱的提取条件。

图6 超声提取时间和干燥温度交互作用对钩藤碱提取率影响的响应面Fig. 6 Response surface curve of the interaction between ultrasound time and drying temperature to rhynchophylline

图7 超声时间和烘干温度交互作用对异钩藤碱提取率影响的响应面Fig. 7 Response surface curve of the interaction between ultrasound time and drying temperature to isorhynchophylline

2.5 样品测定结果

由表5可知，钩藤叶中异钩藤碱的含量高于钩茎中的含量，而钩茎中钩藤碱的含量高于叶中的含量。钩藤常以带钩的茎枝入药，经研究发现钩藤叶中也含有大量的钩藤碱与异钩藤碱，所以钩藤叶具有较大的开发利用价值。

3 讨 论

图8 甲醇浓度和超声提取时间交互作用对异钩藤碱提取率影响的响应面Fig. 8 Response surface curve of the interaction between methanol concentration and ultrasound time to isorhynchophylline

图9 甲醇浓度和烘干温度交互作用对异钩藤碱提取率影响的响应面Fig. 9 Response surface curve of the interaction between methanol concentration and drying temperature to isorhynchophylline

表5 钩藤叶与钩茎中钩藤碱与异钩藤碱的含量测定Table 5 The content of rhynchophylline and isorhynchophylline in leaves and hooks of U. rhynchophylla

生物碱类化合物是许多中草药及药用植物的有效成分[19]，钩藤叶中生物碱的含量和种类与钩中相似[10]。在研究中也发现叶中含有较高的钩藤碱与异钩藤碱成分，并且异钩藤碱含量高于药用部位钩茎中的含量。钩藤作为药材主要以其带钩的茎枝入药，其余部分则作为废料被遗弃。由于钩藤具有良好的降压作用，人们对其的需求量日益增大，而钩的资源非常有限，叶资源却很丰富，每年均可采收，所以将叶弃之不用则造成了很大的资源浪费，因此钩藤叶将是一种值得充分开发利用的资源[11-12]。

研究表明，钩藤中吲哚类生物碱不稳定，高温对钩藤碱和异钩藤碱的破坏极大[20-23]。本试验对材料干燥温度做了探究，结合前期试验研究，发现将叶阴干处理后，几乎很难提出钩藤碱和异钩藤碱，而烘干叶时随着温度的升高，钩藤碱和异钩藤碱含量都呈先上升后下降的趋势，在55 ℃时达到最大，因此可推测钩藤碱和异钩藤碱在55 ℃以下相对稳定。

通过响应曲面法所得到的模型，钩藤叶中钩藤碱和异钩藤碱的优化提取条件为:叶片烘干温度为54.95 ℃时，甲醇浓度73.35%和超声时间60 min，钩藤碱和异钩藤碱能达到的最高提取率为 133.34 μg·g-1和 429.75 μg·g-1。为了试验的方便性，将叶片烘干温度修改为55 ℃，提取条件修改为:甲醇浓度73%和超声提取60 min，藤碱和异钩藤碱的提取率分别为130.80 μg·g-1和425.60 μg·g-1，与模型的预测值相接近，说明此方法得到的最佳提取条件是可靠的。