UPLC-MS/MS同时测定水产品中4种丁香酚类麻醉剂残留量

倪峥飞，顾 晔，冯永巍，薛庆海，王 琴

(无锡产品质量监督检验院，江苏 无锡 214101)

丁香酚类化合物包括丁香酚、异丁香酚、甲基丁香酚、甲基异丁香酚等，自20世纪70年代初发现该类化合物对鱼类有强烈的麻醉作用至今，以其高性价比在水产运输领域得到广泛应用。丁香酚、异丁香酚对鱼类、甲壳类水产品都具有较好的麻醉效果[1]，分别以二者为主要成分制成的丁香油和AQUI-S[2-3]代表性渔用麻醉剂，其中均易残留甲基丁香酚、甲基异丁香酚，进而影响食品安全[4]。

目前，丁香酚类渔用麻醉剂的安全性在国际上仍存在较大争议，特别是甲基丁香酚，国际研究机构通过大量实验证明其对哺乳动物具有致癌作用[5-7]。美国食品药品监督管理局禁止丁香酚、异丁香酚和甲基丁香酚等成分作为新型兽药流通使用[8]，同时终止了对丁香油作为非商品渔用麻醉剂使用的审批[9]，至今未批准养殖鲑鱼使用AQUI-S的申请[11]。但在新西兰、智利等国家，AQUI-S可用于鱼类和贝类的养殖和捕捞[3]。日本规定了丁香酚作为渔用麻醉剂使用时的药浴剂量范围50～200 mg/L和残留限量值0.05 mg/L[10]。目前，我国对丁香酚类渔用麻醉剂的使用尚无明确规定，调查显示，丁香油是我国水产品流通环节使用最广泛的麻醉剂[12]。

丁香酚类化合物的检测方法主要有紫外分光光度法[13]、毛细管电泳法[14]、气相色谱法[15]、液相色谱法[16-18]、气相色谱-串联质谱法[19-20]、液相色谱-串联质谱法[12,21]等。对于水产品等复杂基质样品，光谱法和色谱法虽然操作简单，但无法有效排除杂质和背景干扰，检测限高、灵敏度低。赵东豪等[12]采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)负离子模式测定了鱼肉和水中的丁香酚残留，定量限分别为2.5 μg/kg和0.05 μg/L。孙鹏等[21]针对水产品建立了漂浮固化分散液-液微萃取结合UPLC-MS/MS的方法测定丁香酚，定量限为4.91 μg/kg。由于甲基丁香酚和甲基异丁香酚常混入丁香酚和异丁香酚麻醉剂产品中，影响食品安全，因此有必要建立一种快速、准确的水产品中丁香酚类麻醉剂多残留检测的分析方法。

本研究拟将固相萃取与超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)结合，同时测定水产品中4种丁香酚类麻醉剂的残留量，希望为水产品中丁香酚类麻醉剂的多残留检测提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

1290-6470型超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪：配有电喷雾离子源及MassHunter 8.0数据处理系统，美国Agilent公司产品；BiosafeAvarti J-E冷冻离心机：美国Beckman公司产品；超纯水仪：美国Millipore公司产品；Oasis HLB固相萃取小柱(60 mg/3 mL)：美国Waters公司产品。

1.2 材料与试剂

丁香酚标准品(纯度99.8%)、异丁香酚标准品(纯度97.2%)、甲基丁香酚标准品(纯度98.0%)、甲基异丁香酚标准品(纯度99.6%)：美国Accustandard公司产品；正己烷、乙腈、乙酸乙酯、甲醇：均为色谱纯，德国Merck公司产品；实验用水：符合GB/T 6682—2008规定的一级水，由Milli-Q超纯水系统制备；鲫鱼、对虾：均购于超市，取可食部分经高速组织捣碎机处理后备用。

丁香酚类麻醉剂标准溶液：用乙腈配制1 mg/L 标准储备液，于-18 ℃避光保存，使用时用初始流动相逐级稀释成标准工作液。

1.3 实验条件

1.3.1色谱条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱(50 mm×2.1 mm×1.8 μm)；流动相：A为0.01%甲酸溶液，B为甲醇-乙腈(1∶3，V/V)；流速0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样量5 μL；梯度洗脱程序：0～0.5 min(90%A)，0.5～1.5 min(90%～58%A)，1.5～7.5 min(58%A)，7.5～8 min(58%～10%A)，8～10 min(10%A)，10～11 min(10%～90%A)，11～13 min(90%A)。

1.3.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI)；多反应监测(MRM)正、负离子模式；毛细管电压：正、负离子模式均为3 500 V；干燥气、雾化气、碰撞气、鞘气：均为高纯氮气；鞘气：温度300 ℃，流速11.0 L/min，喷嘴电压500 V；干燥气：温度350 ℃，流速5.1 L/min；多反应监测离子对和质谱条件列于表1。

表1 丁香酚类麻醉剂的质谱多反应监测离子对及质谱参数Table 1 MRM ion pairs and mass spectral parameters for eugenol derivatives anesthetics

注：*表示定量离子

1.4 实验方法

1.4.1样品前处理 称取2.00 g均质样品于50 mL离心管中，加入5 mL正己烷，旋涡振荡10 min，以6 000 r/min离心10 min，转移上清液，残渣用5 mL正己烷按上述步骤重复提取1次，合并2次提取液，置于35 ℃水浴中，氮吹至近干，用3 mL 40%甲醇溶液复溶。

用3 mL甲醇和3 mL水活化HLB固相小柱，将样品液以1 mL/min上样，控制缓慢流速，用3 mL 40%甲醇溶液淋洗、2 mL甲醇洗脱，将全部洗脱液置于35 ℃水浴中，氮吹至不足0.5 mL，再用初始流动相定容至1 mL，过0.22 μm有机滤膜，上机检测。

1.4.2方法学验证 将4种丁香酚类麻醉剂混标储备液用初始流动相配制成浓度分别为1、2.5、5、10、50、100、200 μg/L的混标工作液，建立标准曲线，并考察其线性关系。

向阴性鲫鱼、对虾样品中分别添加2.5、5、25 μg/kg丁香酚类麻醉剂混标溶液，每个加标水平制备6个平行样品，按1.4.1节处理，以外标法定量，考察样品的加标回收率和相对标准偏差(RSD)，评价方法的准确度和精密度。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1色谱条件 本实验比较了甲醇-水、乙腈-水以及甲醇乙腈-水溶液作为流动相的分离情况。结果表明，以甲醇-水、乙腈-水作为流动相时，丁香酚和异丁香酚、甲基丁香酚和甲基异丁香酚2对同分异构体均无法完全分离，这对质谱分析产生干扰；以甲醇乙腈(1∶3，V/V)-水溶液为流动相，且两相体积比为58∶42时，谱图基线平整稳定，2对同分异构体在7.5 min之前均达到完全分离，峰形尖锐、对称、无拖尾，结果示于图1。

图1 10 μg/L丁香酚类麻醉剂标准溶液的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of 10 μg/L eugenol derivatives anesthetics standard solution

流动相pH值对丁香酚类麻醉剂的质谱响应具有显著影响，实验通过向流动相中添加甲酸来控制其pH值，添加甲酸浓度分别为0.01%、0.05%、0.1%、0.2%时，比较获得的目标物信号。结果表明，甲酸浓度为0.01%时，甲基丁香酚和甲基异丁香酚的信号强度明显提高，但进一步提高甲酸浓度，则会抑制丁香酚和异丁香酚的质谱响应，故选择甲酸添加浓度为0.01%。

2.1.2质谱条件 4种丁香酚类麻醉剂的结构式示于图2。丁香酚和异丁香酚均有1个酚羟基，在电喷雾电离下，易丢失1个质子形成[M-H]-准分子离子峰[22]。甲基丁香酚与甲基异丁香酚中酚羟基被甲氧基取代，在电喷雾电离下，易获得1个质子形成[M+H]+准分子离子峰。

将1 mg/L丁香酚类麻醉剂混标溶液进样。首先，选择MS2Scan模式同时以正、负离子模式在m/z100～350范围进行一级质谱扫描。结果表明，负离子模式下，丁香酚和异丁香酚的[M-H]-(m/z163)信号较强；正离子模式下，甲基丁香酚和甲基异丁香酚的[M+H]+(m/z179)信号较强。由此，确定4种化合物的分子离子，然后选择MS2SIM模式以各分子离子响应最大化优化碎裂电压，确定碎裂电压均为90 V。其次，选择子离子模式，分别设定各母离子的碰撞能为10、20、30、40 eV，进行二级质谱扫描，从各组分二级质谱中分别选取2个无干扰、相对丰度较强的特征碎片离子，然后将相对丰度最强的碎片离子与母离子组成定量离子对，次强的碎片离子与母离子组成定性离子对。最后选择MRM模式，分别优化每对离子对的碰撞能，确定最优值；并优化电喷雾离子源参数(包括毛细管电压、干燥气、雾化气、碰撞气等)。质谱多反应监测离子对和质谱条件参数列于表1。

图2 丁香酚类麻醉剂的结构式Fig.2 Chemical structures of eugenol derivatives anesthetics

2.2 样品提取条件的优化

2.2.1提取液的选择 丁香酚类麻醉剂属于极性化合物，难溶于水，易溶于乙腈、乙醚等有机溶剂。本实验对比了正己烷、乙腈和乙酸乙酯对4种丁香酚类麻醉剂的提取效果，结果表明，3种有机溶剂的提取回收率均大于90%，示于图3。乙腈试剂毒性大，且样品浓缩速度显著慢于正己烷和乙酸乙酯，易造成丁香酚类麻醉剂损失；乙酸乙酯提取样品经固相萃取净化后，仍有明显杂质干扰，且基线噪音较大，灵敏度降低；正己烷提取的样品，基线平稳，杂质干扰少，且氮吹浓缩速度相对较快。因此，选择正己烷作为4种丁香酚类麻醉剂的提取溶剂。

图3 不同有机溶剂对丁香酚类麻醉剂的提取回收率Fig.3 Recoveries of eugenol derivatives anesthetics extracted by hexane, acetonitrile or ethyl acetate

2.2.2固相萃取条件的优化 分别采用3 mL不同体积分数(10%～100%)的甲醇溶液对HLB小柱进行丁香酚类麻醉剂的进样和淋洗实验。结果表明，当甲醇溶液的体积分数低于40%时，4种丁香酚类麻醉剂能较好地吸附于HLB小柱上，不会在上样和淋洗时随甲醇溶液过柱而损失，所以采用3 mL 40%甲醇溶液作为固相萃取的上样液和淋洗液。

为确定洗脱液的体积，减少样品浓缩时间，考察了1～5 mL甲醇洗脱4种丁香酚类麻醉剂的回收率，示于图4。结果表明，2 mL甲醇足以将4种丁香酚类麻醉剂从60 mg/3 mL的HLB小柱上完全洗脱。

2.2.3氮吹水浴温度对回收率的影响 丁香酚类麻醉剂具有一定的挥发性。为考察它们在氮吹浓缩时的稳定性，本实验向5 mL甲醇中加入0.1 mL 1 mg/L的4种丁香酚类麻醉剂混标溶液，设定水浴温度分别为25、30、35、40、45 ℃，氮吹浓缩至不足0.5 mL，使用初始流动相定容至1 mL，测定各组分的回收率，结果示于图5。结果表明，水浴温度为25、30、35 ℃时，4种丁香酚类麻醉剂的平均回收率约为97%，相对标准偏差(RSD)小于2.7%；而水浴温度上升至45 ℃时，平均回收率降至90%以下，这可能是由于部分丁香酚类麻醉剂随温度升高挥发分解所致。为保证样品回收率并缩短前处理时间，本研究采用35 ℃作为氮吹水浴温度。

图4 不同体积甲醇洗脱丁香酚类麻醉剂的回收率Fig.4 Recoveries of eugenol derivatives anesthetics correlated with the eluting volumes of methanol

图5 不同氮吹温度下丁香酚类麻醉剂的回收率Fig.5 Recoveries of eugenol derivatives anesthetics correlated with different temperatures of nitrogen blowing

2.3 方法学考察

2.3.1线性关系和定量限 在1～200 μg/L范围内，4种丁香酚类麻醉剂标准溶液的线性关系良好，相关系数R2大于0.996。以定量离子的10倍信噪比确定丁香酚、异丁香酚的定量限(LOQ)均为2.5 μg/kg，甲基丁香酚和甲基异丁香酚的定量限均为1.0 μg/kg，结果列于表2。

2.3.2回收率和精密度 考察了4种丁香酚类麻醉剂的加标回收率和相对标准偏差(RSD)，在2.5、5、25 μg/kg添加水平上，每个浓度设置6个平行样品，同时设1个空白对照，结果列于表3。丁香酚类麻醉剂的加标回收率在77.6%～111.4%之间，相对标准偏差为2.7%～9.1%，可见该方法的准确性和重现性较好，能够满足兽药残留分析要求。

表2 丁香酚类麻醉剂的线性范围、线性相关系数、定量限Table 2 Linear ranges, correlation coefficients (R2), limits of quantification (LOQs) of eugenol derivatives anesthetics

表3 水产品中丁香酚类麻醉剂的加标回收率和精密度Table 3 Recoveries and precision of eugenol derivatives anesthetics in aquatic products

2.3.3基质效应 通过比较空白样品提取液添加混标溶液与纯溶剂标液的离子响应强度[23]，考察水产品中丁香酚类麻醉剂的基质效应。设定基质因子(matrix effect)%=基质溶液中定量离子响应值/纯溶剂中定量离子响应值，分别在2.5、50、200 μg/kg添加浓度下评价基质效应，添加浓度2.5 μg/kg的鲫鱼样品MRM色谱图示于图6。当基质抑制目标组分的响应时，基质因子<100%；当基质增强目标组分的响应时，基质因子>100%；若不存在基质效应，基质因子=100%。结果表明，水产品基质对4种丁香酚类麻醉剂均产生一定程度的离子抑制，但在3个添加浓度下，基质因子均在80%～100%之间，说明所建立的固相萃取前处理方法的样品净化效果较好。

2.4 实际样品检测

采用本法检测了随机购买的30份市售鲜活水产品(包括10份鲫鱼、10份鳊鱼、10份对虾)，所有样品均未检出丁香酚类麻醉剂。

图6 2.5 μg/kg添加水平下的鲫鱼样品MRM色谱图Fig.6 MRM chromatograms of standard addition concentration (2.5 μg/kg) of crucian samples

3 结论

本研究建立了固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)快速、同时测定水产品中4种丁香酚类麻醉剂残留量。样品用正己烷提取，经HLB固相小柱萃取净化，以多反应监测(MRM)正、负离子模式同时测定，实现了一次性同时测定水产品中4种丁香酚类麻醉剂残留。该方法操作简便、快捷、灵敏度高、稳定性好，适用于水产品中丁香酚类麻醉剂多残留的快速定性和定量分析。