痛风宁胶囊对痛风性肾病模型小鼠主要脏器病理损伤的改善作用

樊海瑞，赵 岩，傅警龙，张海波，王德超，郜玉钢，张连学

(1.吉林农业大学中药材学院人参工程技术研究中心，吉林 长春130118；2.吉林省长春市长中风湿骨病医院风湿科，吉林 长春130021)

痛风是一组嘌呤代谢紊乱、血尿酸水平升高所致组织损伤的异质性疾病，常累及肾脏，引起肾尿酸结石及肾间质病变[1]。目前用于治疗痛风的药物主要有秋水仙碱(colchicine)、白细胞介素1β(interleukin-1β)抑制剂、非甾体抗炎药(NSAIDs)、促肾上腺皮质激素类(ACTH)和皮质类固醇类(corticosteroids)等[2]。此类药物虽作用迅速且效果明显，但患者需长期使用并常伴有严重的不良反应。我国相关专业研究者[3-11]在建立痛风动物模型和观察药物疗效等领域进行了大量考察，证实有些中药具有治疗痛风及其并发症的效果。

痛风宁胶囊(TFN，长春医药大学风湿骨病医院提供)组方由土茯苓、泽兰、蚕砂、黄柏、大黄和金钱草等21味中药组成，是长春中医药大学风湿骨病医院临床多年应用的经验方，在临床上已使用十余年，对痛风具有良好的治疗效果[12-13]。本文作者主要研究不同剂量TFN对腺嘌呤联合乙胺丁醇片所致痛风性肾病模型小鼠主要脏器病理损伤的改善作用，为进一步开发和利用TFN提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物、主要试剂和仪器 70只雄性KM小鼠，SPF级，体质量(20±2)g，购自长春市生物制品研究所有限责任公司，动物许可证号：SCXK(吉)2011-0003。TFN胶囊(规格：0.5 g，批准文号：吉药制字Z2007A050)，长春市长中风湿骨病医院提供；痛风舒片(TFS)(规格：0.3 g，生产批号：20141201)，山西仁源堂药业有限公司；别嘌醇片(规格：0.1 g，生产批号：20150422)，世贸天阶制药(江苏)有限责任公司；腺嘌呤(货号：A8626-100G)，美国Sigma公司；盐酸乙胺丁醇片(规格：0.25g，批准文号：国药准字H21022349)，沈阳红旗制药有限公司。尿酸(UA)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN) 、黄嘌呤氧化酶(XOD) 、单核趋化蛋白(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和环氧化酶(COX-2)试剂盒均购自长春百金生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。酶标仪(SPECTRAMAX190)，美谷分子仪器(上海)有限公司。

1.2 动物模型的制备和分组[14- 15]70只健康小鼠适应性饲养1周后随机分为7组：对照组，模型组，别嘌醇片和TFS阳性药对照组，低、中和高剂量TFN组，每组10只。除对照组之外，其他各组小鼠均以腺嘌呤(100 mg·kg-1)和盐酸乙胺丁醇片(250 mg·kg-1)灌胃给药进行造模，每天1次。第8天模型制备成功后，各组小鼠开始灌胃给药，共给药14 d。根据人与实验动物给药量的剂量换算[16]，低、中和高剂量TFN组TFN剂量分别为200、400和800 mg·kg-1，别嘌醇片剂量为50 mg·kg-1，TFS剂量为600 mg·kg-1;对照组和模型组小鼠均灌胃给予等量生理盐水。

1.3 指标检测和方法[17]实验第22 天 给药1 h后，小鼠摘眼球取血，3 000 r·min-1离心10 min，分离血清，按试剂盒说明书采用酶联反应法测定血清中UA、Cr、BUN、MCP-1、TNF-α和XOD水平。取小鼠肾脏迅速与生理盐水1∶9混合，匀浆，匀浆液取上清检测小鼠肾组织中COX-2活性。

1.4 HE染色观察小鼠肾脏、胸腺和脾脏组织病理形态表现 实验第22天给药1 h后，小鼠脱颈椎处死，取其肾脏、胸腺和脾脏组织，用预冷生理盐水进行清洗并称质量，10%甲醛溶液固定24 h，脱水石蜡包埋，切片，置于干净载玻片后，HE染色，光镜下观察组织病理形态表现。

2 结 果

2.1 各组小鼠血清中UA、Cr和XOD水平 与对照组比较，模型组小鼠血清中UA、Cr和XOD水平均明显升高(P<0.01)。与模型组比较，别嘌醇片和TFS阳性药对照组及高剂量TFN组小鼠血清中UA、Cr和XOD水平均明显降低(P<0.01)，低和中剂量TFN组小鼠血清中UA、Cr和XOD水平有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠血清中UA、Cr和XOD水平

GroupDose(mg·kg-1)Cr[cB/(μmol·L-1)]XOD[ρB/(ng·L-1)]UA [ cB/ (μmol·L-1)]Control 055.53±11.4311.53±1.8961.13±7.17Model 0113.42±18.29∗55.65±10.23∗103.74±18.82∗Allopurinol50 68.91±6.65△22.58±2.11△76.47±13.75△TFS600 67.43±9.54△23.81±1.38△77.47±8.01△TFN Low dose200 98.11±8.5351.46±3.8491.82±11.14 Medium dose400 94.91±15.1346.33±7.5989.95±6.74 High dose800 70.26±12.25△25.99±1.93△80.77±8.60△

*P<0.01vscontrol group；△P<0.01vsmodel group.

2.2 各组小鼠血清中MCP-1、TNF-α和BUN水平 与对照组比较，模型组小鼠血清中BUN、MCP-1和TNF-α水平均明显升高(P<0.01)。与模型组比较，别嘌呤醇和TFS阳性药对照组及高剂量TFN组小鼠血清中BUN、MCP-1和TNF-α水平均明显降低(P<0.01)，低和中剂量TFN组小鼠血清中BUN、MCP-1和TNF-α水平有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组小鼠血清中MCP-1、TNF-α和BUN水平

GroupDose(mg·kg-1)MCP-1[ρB/(ng·L-1)]TNF-α[ρB/(ng·L-1)]BUN[cB/(pmol·L-1)]Control 0217.27±27.4261.42±16.05105.78±22.70Model 0300.75±28.74∗125.04±14.27∗194.26±19.75∗Allopurinol50 237.58±19.38△75.43±4.76△124.26±11.97△TFS600 241.99±16.84△77.10±8.17△123.17±18.99△TFN Low dose200 284.72±19.07110.81±7.34181.83±23.83 Medium dose400 280.39±22.70109.33±11.81177.01±21.53 High dose800 251.55±27.45△86.71±6.49△134.78±13.57△

*P<0.01vscontrol group；△P<0.01vsmodel group.

2.3 各组小鼠肾组织匀浆上清液中COX-2活性 与对照组比较，模型组小鼠肾组织匀浆上清液中COX-2活性明显升高(P<0.01)。与模型组比较，别嘌呤醇和TFS阳性药对照组及高剂量TFN组小鼠肾组织匀浆上清液中COX-2活性均明显降低(P<0.01)，低和中剂量TFN组小鼠肾组织匀浆上清液中COX-2活性有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组小鼠肾组织匀浆上清液中COX-2活性

Tab.3 Activities of COX-2 in kidney tissue homogenate in mice in various groups

GroupDose(mg·kg-1)COX-2Control 042.01±3.99Model 092.10±18.77∗Allopurinol50 54.79±8.61△TFS60055.32±10.89△TFN Low dose200 82.71±13.15 Medium dose400 78.51±10.28 High dose800 66.50±8.18△

*P<0.01vscontrol group；△P<0.01vsmodel group.

2.4 各组小鼠肾脏组织病理形态表现 对照组小鼠肾组织中肾小球、肾小管和肾间质形态均正常。与对照组比较，模型组小鼠肾组织中肾小球萎缩，肾小管水肿，肾小管和肾间质出现大量尿酸盐结晶。与模型组比较，别嘌呤醇和TFS阳性药对照组及高剂量TFN组小鼠肾脏组织病变明显改善，肾小球与肾间质可见少量的尿酸盐结晶,低和中剂量TFN组小鼠肾脏组织病变无明显改变(图1，见插页二)。

2.5 各组小鼠胸腺组织病理形态表现 对照组小鼠胸腺分叶清楚，胸腺皮质细胞密集。与对照组比较，模型组小鼠胸腺皮质和髓质分界不清晰，细胞稀疏。与模型组比较，别嘌呤醇和TFS阳性药对照组及高剂量TFN组小鼠胸腺病理变化明显改善，低和中剂量TFN组小鼠胸腺病理变化有一定程度改善，但表现不明显(图2，见插页二)

2.6 各组小鼠脾脏组织病理形态表现 对照组小鼠脾脏中红髓和白髓分界清晰，脾小结淋巴细胞密集，脾窦无充血现象。与对照组比较，模型组小鼠脾脏红髓和白髓分界不清晰，脾小结不同程度缩小，脾窦出现充血现象。与模型组比较，别嘌呤醇和TFS阳性药对照组及高剂量TFN组小鼠脾脏病理变化明显改善，脾脏红髓和白髓分界较清晰，脾脏充血现象得到改善，低和中剂量TFN组小鼠脾脏病理变化有一定程度改善，但不明显(图3，见插页二)。

3 讨 论

治疗痛风的西药有较多的不良反应，如秋水仙碱具有恶心、腹泻等不良反应；非甾体抗炎药会导致肾损伤、胃肠道溃疡和出血等，IL-1β抑制剂有加重痛风症状的危险[18-19]。由于以上不良反应，临床上治疗痛风时会遇到对各种药物使用的限制问题。传统中医药在治疗痛风方面具有标本兼治的特点，且中药复方联合用药具有增效和减毒的优势[20-21]。

本研究结果显示：TFN可以较好地缓解痛风性肾病患者的各项病理变化，而且在实验过程中受试小鼠生长正常，无腹泻等不良反应。本研究中，高剂量TFN组小鼠血清中UA、Cr、BUN、MCP-1、TNF-α和XOD等生化指标水平明显降低，肾组织中COX-2水平明显降低；同时，高剂量TFN具有改善小鼠肾脏肾小球萎缩现象、清除肾小管与肾间质尿酸盐结晶和缓解胸腺及脾脏等脏器病理变化的效果，使脾脏脾窦充血现象得到缓解、胸腺皮质和髓质分界较清晰，而低和中低剂量TFN组小鼠上述病理改变不明显。

研究[22-25]显示：黄酮类化合物如槲皮素、山奈酚、木犀草素和桑色素等对于治疗痛风发挥着重要作用。本课题组前期研究显示：TFN组方中含有生物碱及黄酮类等化合物。本实验结果为进一步利用该组方治疗痛风性肾病提供了实验依据。