高效液相色谱法检测牛肉中3类12种兽药残留的研究

（广西兽药监察所，广西南宁 530001）

兽药对于动物疾病的预防、诊断、治疗来说都是非常重要的。但是如果不合理的使用兽药，无疑会导致动物体内药物的滞留和蓄积，并以残留方式进入人体或生态系统[1]。兽药残留的毒性作用大多是通过长期积累而造成的，比如磺胺类药物残留的副反应有过敏反应、泌尿系统损害、血液系统的反应；四环素类药物残留容易与骨骼中的钙结合，从而抑制骨骼和牙齿的生长；氯霉素能引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症等疾病。氯霉素是禁用药物[2]，磺胺类、四环素类兽药是兽医临床上常用[3]且容易被滥用的药物。因此建立兽药多残留快速检测方法非常有必要。

国内外现有的多残留检测方法主要有LC-Q-TOF[4-6]和LC-MS/MS[7-10]等方法，串联质谱法虽然灵敏度高、定性准确，但仪器昂贵，日常维护保养较烦琐，需要具备较专业的知识和操作水平，不适宜基层检测机构的日常监控工作。本研究采用固相萃取-高效液相色谱法对牛肉中3类12种兽药残留进行检测，方法操作简单，能够满足日常兽药残留快速风险筛查及监测工作的需要。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

主要仪器：高效液相色谱仪（Waters公司，e2695/2998）；分析天平（METTLER TOLEDO公司，PB602-S）；高速冷冻离心机（SIGMA公司，3K15）；超声波水浴（昆山市超声仪器有限公司，KQ-250DB）；固相萃取装置（Waters公司）；氮气吹干仪（Organomation Associates公司，N-EVAP 116）；涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，QL-901）；50mL具塞塑料离心管；微孔滤膜（0.22µm）；Oasis PRiME HLB固相萃取柱（Waters公司，6cc/200mg）。

主要试剂：乙腈、乙酸为色谱纯；水为超纯水；乙二胺四乙酸二钠为分析纯。0.1mol/L EDTA溶液：准确称取1.86g乙二胺四乙酸二钠加纯水30mL超声溶解，定容至50mL。

磺胺类标准品：磺胺嘧啶（SD）、磺胺甲基异噁唑（SMZ）、磺胺二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺甲氧哒嗪（SMP）、磺胺喹噁啉（SQ）、磺胺二甲嘧啶（SM2）来源Dr. Ehrenstorfer Gmbh，磺胺间甲氧嘧啶（SMM）来源中国兽医药品监察所；四环素类标准品：金霉素（CTC）、土霉素（OTC）、四环素（TC）、多西环素（DC）来源Dr. Ehrenstorfer Gmbh；氯霉素（CAP）标准品，来源中国食品药品检定研究院，用乙腈溶解配制成浓度为10.0mg/mL的标准储备液，临用时准确量取适量标准储备液用流动相稀释成适宜浓度的标准工作液。

1.2 样品处理

1.2.1 提取 准确称取5.00g均质后的牛肉样品，置于50ml具塞塑料离心管中，分别加入1.0ml0.1mol/L EDTA溶液和10ml含1%乙酸的乙腈溶液，充分涡旋混匀后，超声波提取30min，以10000 r/min离心5min。

1.2.2 净化 取上清液1.0ml淋洗Oasis PRiME HLB固相萃取柱，流出液弃去。再加入上清液5.0ml过Oasis PRiME HLB固相萃取柱，收集流出液，于45℃用氮气吹干，残留物用0.5ml初始流动相定容，涡旋混合1min，过0.22µm微孔滤膜后作为试样溶液，供HPLC测定。

同时作空白样品的处理，均按上述测定条件和步骤进行平行操作。

1.3 HPLC测定条件

色谱柱：XTerra®MS C18，5µm，250mm×4.6mm column；流动相：A相为乙腈，B相为0.2%乙酸溶液；梯度洗脱程序：0～5min，10%A；5～15min，10%～15%A；15～25min，15%～20%A；25～40min，20%A；40～50min，20%～10%A；50～60min，10%A；流速：1.0 mL/min；柱温：室温；进样量：50µl；检测器：二极管阵列检测器，波长范围：210nm到400nm。

1.4 添加回收率、检测限（LOD）和精密度的确定

取空白牛肉样品5.00g，加入一定体积的混标标准工作液，使在样品中的磺胺类、氯霉素浓度分别为0.02、0.04、0.10mg/kg、四环素类浓度分别为0.05、0.1、0.25mg/kg；另取空白牛肉样品，不添加标准工作液。添加与空白均按上述样品前处理方法进行处理，作HPLC测定。再将相对应浓度的标准工作液作HPLC测定分析，计算各对应质量浓度的回收率。各空白样品测得基线噪音值，按信噪比S/N≥3为检测限。每个浓度点进行5个平行样品的测试，3次重复，根据色谱峰峰面积分别计算各浓度点的添加回收率、变异系数及相对标准偏差。

2 结果与分析

2.1 样品提取剂的优化

甲醇和乙腈[10～12]是常用于兽药多残留检测的有机溶剂。本实验考察了乙腈、甲醇、1%乙酸-乙腈溶液等提取液。结果表明，使用乙腈提取效果好于甲醇提取液。四环素类药物易与组织中的金属离子络合，以及与组织中的蛋白强烈结合。提取时加入1.0mL0.1mol/L EDTA溶液，能避免四环素类药物因络合而造成回收率降低[13-14]。本文采用含1%乙酸的乙腈溶液作为提取液能最大限度提取出有效成分并使共萃取的干扰物较少，添加回收结果理想，回收率稳定。

2.2 样品净化条件的优化

样品净化采用了极性吸附原理的固相萃取柱，使用通过策略进行固相萃取净化。PRiME HLB固相萃取柱是在HLB亲水亲脂平衡的水可浸润性的反相吸附剂的基础上，能有效去除样品中的蛋白、磷脂、维生素和矿物质等基质干扰物，不影响吸附剂床的干涸，无须活化，直接上样，简化了实验步骤，对复杂基质能达到较好的净化效果[15]。

2.3 液相色谱检测

采用本试验中样品处理方法，在上述色谱条件下，标准溶液、空白样品和试样溶液的高效液相色谱图分别见图1、图2、图3。通过图谱分析可知，本法中各组分出峰时间较稳定，干扰杂质较少。

图1 标准溶液色谱图

图2 空白样品色谱图

图3 空白添加色谱图

2.4 线性范围、相关系数及检测限

在本方法确定的实验条件下，采用空白样品中添加标准工作液的方法制备标准工作曲线，磺胺类和氯霉素添加浓度为0.02、0.04、0.08、0.10、0.20mg/kg、四环素类浓度分别为0.05、0.1、0.20、0.50、1.0mg/kg，每个浓度点进行5个平行样品的实验，分别进样用平均值绘制标准曲线，获得的各组分的线性范围、相关系数及方法检测限（S/N≥3）见表1。

表1 牛肉中12种化合物线性范围、相关系数、方法检测限、平均回收率及精密度

2.5 方法的添加回收率和精密度

本研究建立的牛肉样品中12种药物残留检测方法，平均回收率为51%～133%，相对标准偏差均小于20%。平均回收率和精密度结果见表1。

3 结论

本研究采用通过固相萃取前处理，高效液相色谱法检测，样品操作简单、快速、净化效果好，缩短了检测周期，节约了检测成本，准确度和精密度好，可用于多种药物在牛肉中残留检测，为基层检测机构提供了简单快速的筛选方法，有助于应对多残留检测的日常监控。