葡萄糖酸铬对锦鲤血清中4种激素及肝胰脏中糖代谢相关酶活性的影响

崔培，王景倩，程镇燕，牟希东，乔秀亭，孙金辉

(1.农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广东 广州 510380；2.天津农学院 水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384)

糖类是廉价且重要的能源物质，与陆生动物相比，鱼类对糖的利用能力较差[1-2]，能量需求依赖价格昂贵的蛋白质提供，不仅导致饲料价格昂贵，还增加了鱼体的代谢负担，加剧氮磷排泄，污染养殖环境[3-4]。若能利用价格低廉的糖类作为能源物质替代部分蛋白质，起到“蛋白质节约作用”，不仅可以降低饲料蛋白质含量和成本，同时还可以保护渔业资源，减少养殖过程中氮排泄对水体的污染[5]。

Cr3+是人和动物体必需的一种痕量元素，与机体碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢密切相关。研究证实，Cr3+能够通过增强胰岛素的作用进而提高机体葡萄糖耐量[6-7]。相关学者发现，饲料中添加适量的Cr3+能够提高动物机体生长性能[8-9]，降低血糖浓度，改善机体葡萄糖耐量[10-11]，促进机体对糖类的利用能力[12-13]，增强机体的免疫功能和应激能力[14-17]。因而，Cr3+作为一种饲料添加剂已被广泛应用在畜禽动物和一些水产动物养殖中。与无机铬相比，有机铬具有更高的吸收率和生物学活性[18]，因此，在畜禽以及水产动物饲料中多以有机铬形式添加，添加铬源主要包括吡啶羧酸铬、酵母铬、烟酸铬等。吡啶羧酸铬因其稳定性强、易于吸收且效价最高等优势成为应用最为广泛的铬源，但吡啶羧酸铬可能引起DNA的裂解反应，从而导致DNA损伤[19]；而烟酸铬在酸性环境下稳定性差，在消化吸收过程中容易造成较大损失，烟酸的

化学结构也决定了烟酸同铬之间的有机螯合度差。故本试验中选择易于吸收且具有高生物学活性的葡萄糖酸铬作为铬源。

锦鲤Cyprinuscarpio因其体色艳丽、易于饲养而广受消费者欢迎。目前，有关Cr3+作为锦鲤饲料添加剂的研究报道较少，本试验前期曾研究了不同葡萄糖酸铬含量对锦鲤生长、血液和抗氧化指标的影响[20]，但对于葡萄糖酸铬影响其糖利用能力等方面的研究尚未见报道。为此，本试验中在前期研究的基础上探讨了不同葡萄糖酸铬含量对锦鲤部分激素水平和糖代谢酶活性的影响，旨在为进一步验证葡萄糖酸铬可否作为锦鲤配合饲料添加剂来使用提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验中，以天津市天祥水产有限责任公司提供的天祥585饲料为底料(蛋白质含量32%，脂肪含量5%)，配制7种不同葡萄糖酸铬含量的试验饲料，添加量分别为0(对照)、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/kg(以Cr3+计)。饲料中采用原子吸收光谱法(石墨炉原子化法)测定Cr3+含量，实测值分别为0.74、0.86、0.95、1.15、1.59、2.40、4.01 mg/kg。葡萄糖酸铬购自湖北拓楚慷元医药化工有限公司，有效含量为97.87%，Cr3+含量为8%。饲料底料经多功能粉碎机粉碎后，用制粒机挤压成直径为1.5 mm 的颗粒料，在烘箱 (DK400, YAMATO)(40 ℃)中烘干2 h，取出后自然风干至水分约12%，于冰箱(-20 ℃)中保存备用。

1.2 方法

1.2.1 试验设计与饲养管理 试验鱼购自天津精武镇观赏鱼养殖基地，运送至天津市水产生态及养殖重点实验室后进行两周暂养驯化，期间投喂对照组饲料，待试验鱼适应养殖环境后，选取大小基本一致、初始体质量为(4.18±0.38)g的健康试验鱼525尾随机分为7组，每组设3个重复，每个重复25尾鱼。每日于8:30和16:30表观饱食投喂1 h后吸去水槽底部的残饵和粪便。每天换水1次，换水量约为总水量的1/3～1/2，养殖容器为21个300 L蓝色塑料水槽，试验用水为曝气24 h以上的自来水，试验期间水温为(28.0±1.0)℃，pH为(7.0±0.2)，氨氮≤0.05 mg/L，溶解氧≥5.0 mg/L。饲养周期为8周。

1.2.2 样品采集 8周饲养试验结束后，试验鱼禁食24 h，用MS-222(40 mg/L)将鱼麻醉后，每槽随机选取20尾试验鱼并从尾部采血，于4 ℃下以4000 r/min离心5 min，取上清液。取血后的试验鱼迅速于冰盘上解剖取其肝胰脏，取出后用4 ℃去离子水冲净，并按质量与体积比为1∶9加入预冷的双蒸水，使用玻璃匀浆器制成体积分数为10%的组织匀浆液，取上清液于4 ℃下以3000 r/min离心10 min。所有样品处理后均转入超低温冰箱(-80 ℃)中保存备用。

1.2.3 试验指标的测定 采用ELISA试剂盒测定血清胰岛素(Insulin, INS)、胰高血糖素(Glycogen, GC)、胰岛素受体(Insulin Receptor, ISR)、皮质醇(Cortisol)。INS、GC试剂盒均购自Assay Designs(美国)，COR、ISR试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。

采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, PK)、琥珀酸脱氢酶(Succinic acid dehydrogenase, SDH)、苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase, MDH)活性，采用美国Assay Designs 公司的ELISA试剂盒测定葡萄糖激酶(Glucokinase, GK)、磷酸烯醇式丙酮酸激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose 6-phosphatase dehydrogenase, G6PDH)、葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase, G6P)活性。

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)，用Duncan氏法进行多重比较分析，显著性水平设为0.05，试验结果均用平均值±标准差(mean ± S.D.) 表示。

2 结果与分析

2.1 不同Cr3+添加量下锦鲤血清激素水平的变化

从表1可见：在饲料中添加Cr3+后能显著降低锦鲤血清皮质醇含量(P<0.05)；胰岛素水平随Cr3+添加量的增加呈先升高后降低的趋势，最高值出现在Cr3+添加量为0.8 mg/kg组，且显著高于对照组(P<0.05)，其他各组间均无显著性差异(P>0.05)；胰岛素受体水平在Cr3+添加量≥0.4 mg/kg时显著高于对照组及0.1 mg/kg组(P<0.05)；而不同Cr3+添加量未对胰高血糖素造成显著影响(P>0.05)。

表1 不同葡萄糖酸铬添加量对锦鲤血清4种激素水平的影响

注：同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同

Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

2.2 不同Cr3+添加量下锦鲤肝胰脏代谢酶活力的变化

从表2可见：GK活性在Cr3+添加量为0.2～3.2 mg/kg时均显著高于对照组(P<0.05)，最高值出现在0.8 mg/kg组，显著高于其他各组(P<0.05)；PK活性除Cr3+添加量为3.2 mg/kg组外，其他Cr3+添加组均显著高于对照组(P<0.05)；添加葡萄糖酸铬后，各组试验鱼G6P活性均低于对照组，Cr3+添加量≥0.2 mg/kg时，各添加组G6P活性均显著低于对照组(P<0.05)；PEPCK活性则在Cr3+添加量为0.1～1.6 mg/kg时显著低于对照组(P<0.05)；G6PDH活性随葡萄糖酸铬添加量的增加呈先升高后降低的趋势及Cr3+添加量为0.4～0.8 mg/kg时，G6PDH活性显著高于对照组及Cr3+添加量为0.1、1.6、3.2 mg/kg组(P<0.05)；SDH活性在Cr3+添加量≥0.8 mg/kg时，均显著高于对照组(P<0.05)；除Cr3+添加量为3.2 mg/kg组MDH活性显著高于对照组(P<0.05)外，其余Cr3+添加组MDH活性均与对照组无显著性差异(P>0.05)。

表2 不同葡萄糖酸铬添加量对锦鲤肝胰脏中糖代谢酶活力的影响

3 讨论

3.1 葡萄糖酸铬对锦鲤血清激素水平的影响

Cr3+通过增强胰岛素的作用进而发挥其生物学功能。有关补铬对动物体胰岛素影响的研究结果不尽一致。Sahin等[19]发现，补铬未对怀孕、新生及断奶兔子血清中胰岛素水平产生影响。对大鼠[21]的研究显示，补铬能有效降低血清中胰岛素水平。推测其原因可能是铬以活性形式增强机体胰岛素的内化率，促进骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取，使得血液循环中胰岛素和血糖含量降低[22]。而Kim等[23]对肉仔鸡的研究发现了与上述研究相反的结果，补充铬能显著提高血清胰岛素水平。目前，有关Cr3+影响鱼类胰岛素水平的报道较少，Liu等[24]在草鱼Ctenopharyngodonidellus饲料中添加不同水平的吡啶羧酸铬(CrPic)，结果显示，适量吡啶羧酸铬能显著提高草鱼血清胰岛素水平。本试验结果与Liu等[24]研究结果相类似，在饲料中添加葡萄糖酸铬后，试验鱼血清胰岛素水平均有所升高，其中，Cr3+添加量为0.8 mg/kg组的试验鱼血清胰岛素水平最高且显著高于对照组，证实了铬作为胰岛素辅因子来协同胰岛素功能的生理学作用。有研究报道，Cr3+是通过增加胰岛素受体数量或促进胰岛素和细胞膜上的受体IR结合，从而提高细胞对葡萄糖敏感性[7]，本试验中胰岛素受体水平在Cr3+添加量为0.4～3.2 mg/kg后显著升高，也证实了上述观点。本试验中，在饲料中添加了葡萄糖酸铬后锦鲤血清皮质醇含量均显著降低，说明葡萄糖酸铬对提高锦鲤抗应激作用具有明显效果，这也与Ahmed等[9]对鲤CyprinuscarpioL.和Castro等[15]对罗非鱼Oreochromisniloticus×Oreochromisaureus的研究结果相一致。此外，本试验中锦鲤胰岛素水平与皮质醇含量呈反向相关这一结果反映出典型的胰岛素(合成代谢)与皮质醇(分解代谢)间的代谢关系，而葡萄糖酸铬的添加未改变这种相关性。

3.2 葡萄糖酸铬对锦鲤肝胰脏糖代谢酶活性的影响

糖酵解是葡萄糖分解产生能量的一个重要过程，而葡萄糖激酶和丙酮酸激酶是糖酵解途径中重要的限速酶。GK也被称为Ⅳ型己糖激酶，是糖酵解过程中的第一个限速酶，催化葡萄糖磷酸化生成G6P。当机体GK缺乏或活性较低时，会导致鱼体对饲料中糖的利用能力降低。PK催化的反应是葡萄糖生成丙酮酸的最后一步反应，即催化磷酸烯醇式丙酮酸转化成丙酮酸。研究发现，虹鳟Oncorhynchusmykiss、金头鲷Sparusaurata、鲤[25]、青鱼MylopharyngodonpiecesRichardson和南方鲇Silurusmeridionalis[26]等的GK、PK活性受到饲料糖水平的调控，高糖饲料能够诱导GK、PK活性增强。而本试验中在饲料中添加葡萄糖酸铬后均能诱导锦鲤肝胰脏GK和PK活性增强，说明葡萄糖酸铬具有促进锦鲤糖酵解过程的作用。

磷酸烯醇式丙酮酸激酶和葡萄糖-6-磷酸酶是糖异生途径的关键限速酶。其中，PEPCK催化糖异生作用的第一步，将草酰乙酸盐转变成磷酸烯醇式丙酮酸盐，对能量代谢具有重要的意义[4]。G6P则催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖，这一反应是糖异生作用对糖酵解的不可逆作用的一种迂回方式。Kramer等[27]研究发现，铬通过在动物体内形成核酸衍生物进而直接抑制PEPCK活性。此外，Gardner等[28]研究发现，胰岛素自身通过抑制其PEPCK的表达从而抑制PEPCK活性，因此，铬的补充能够通过加强胰岛素作用进一步间接抑制PEPCK活性。本试验中，在Cr3+添加量≥0.2 mg/kg时，锦鲤G6P和PEPCK活性均有显著降低，与上述研究相类似。此外，乔伟[29]对大鼠的研究也发现类似结果。

磷酸戊糖途径是机体糖分解代谢的另一条重要途径，此过程能够提供大量烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，参与机体许多代谢反应。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径的关键酶，它促使磷酸戊糖核酸、NADPH的合成反应并维持细胞的氧化还原状态。本试验中，在饲料中Cr3+添加量为0.4～0.8 mg/kg时能显著提高G6PDH活性。而Pan等[30]对罗非鱼的研究结果发现，在饲料中添加吡啶羧酸铬2 mg/kg时未对其G6PDH活性产生显著影响，其原因可能与试验对象、所用铬源、铬离子添加水平、饲料糖源及养殖条件不同有关。

三羧酸循环是需氧生物体内普遍存在的代谢途径。苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的重要脱氢酶。有研究表明，补充吡啶羧酸铬能有效提高肉鸡和猪的MDH 活性，从而对糖代谢进行调控[31]。而对于鱼类而言，Pan等[30]研究发现，在饲料中添加吡啶羧酸铬未对罗非鱼MDH活性产生显著影响。本试验与上述结果相类似，在饲料中添加葡萄糖酸铬未对锦鲤肝胰脏中MDH活性产生显著影响。铬是琥珀酸-细胞色素脱氢酶、葡萄糖磷酸变位酶等酶系的必需微量元素，它参与机体糖、脂代谢过程。乔伟[29]对大鼠的研究表明，在日粮中添加小肽铬能显著提高三羧酸循环途径中SDH 活性，促进机体葡萄糖分解供能。本试验结果显示，Cr3+添加量≥0.8 mg/kg时，锦鲤肝胰脏SDH活性显著升高，此结果与上述研究结果相一致。

4 结语

葡萄糖酸铬能够提高锦鲤胰岛素和胰岛素受体水平，降低皮质醇含量，同时，还能诱导糖酵解途径、磷酸戊糖途径和三羧酸循环途径酶活性，抑制糖异生途径酶活性，从而提高自身糖利用能力，建议锦鲤饲料中葡萄糖铬添加量为0.8 mg/kg(以Cr3+计)。