细叶百合LpSVP基因的克隆及其表达分析

汪 王，苏小霞，杨柳慧，周蕴薇

(东北林业大学 园林学院，黑龙江 哈尔滨 150000)

细叶百合(Liliumpumilum)是百合属中分布最广，纬度偏北的一种野生花卉，其花色艳丽，观赏价值高，对镰刀菌，叶枯病，盐渍化，干旱和低温具有较强的抗性，是百合抗性育种的重要亲本[1]，同时鳞茎营养价值高，是食用、药用和观赏俱佳的草本植物。对其花发育基因的研究，是运用分子生物学手段调控花期，实现促成栽培的基础[2]。

目前，拟南芥是研究开花最为深入的模式植物，许多调控开花时间的基因都已经克隆鉴定，如促进开花的基因有AGAMOUS-LIKE20(AGL20)，AGAMOUS-LIKE24(AGL24)，SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1(SOC1)，FLOWERINGLOCUST(FT)等[3-5],抑制开花的基因有FLOWERINGLOCUSC(FLC)，FLOWERINGLOCUSM(FLM)，FRIGIDA(FRI)等[6-8]。SHORTVEGETATIVEPHASE(SVP)属于MADS-box转录因子家族一员，并且对开花具有抑制作用，它能整合自主途径、春化途径和赤霉素途径开花信号，从而调控植物开花时间[9]。有文献报道，在ga1-3突变体中SVP表达量较高，而在赤霉素处理后的野生型植物中表达量降低[10]，可见赤霉素途径能负调节SVP。关于SVP对开花的调控机制，已有详细报道。C.Jung[11]等通过免疫沉淀法和GST融合技术分别证实了拟南芥中2个开花信号整合子SVP和FLC在体内和体外均能构成蛋白复合物，J.H.Lee[12]等进一步发现SVP-FLC蛋白复合物能抑制FT及FT的靶基因SOC1的表达，且SVP通过直接结合FT序列中的CArG基序，负调控开花整合子FT，从而调控植物开花时间。SVP功能基因的研究，对花期调控具有重要意义。

本研究从MADS-box家族中克隆得到LpSVP基因，通过蛋白质特性分析、同源蛋白聚类以及基因时空表达分析，初步阐明LpSVP的作用机制，为进一步研究该基因功能和机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为东北林业大学园林学院苗圃引种的野生细叶百合。

1.2 细叶百合LpSVP总RNA提取与cDNA合成

总RNA的提取参照天根生化科技(北京)有限公司试剂盒说明进行，并采用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的完整性和纯度。参照PrimeScripTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)试剂盒说明，以0.5 μg为模板，合成cDNA第1链。

1.3 细叶百合LpSVP基因克隆

从细叶百合转录组cDNA文库中获得该基因最大开放阅读框(ORF),利用primer 5.0设计特异性上下游引物LpSVP-F GTGGGTGGTGAGATCAGATG;LpSVP-R ATAGGGTAATTGCTGGACAT。以反转录cDNA为模板，参照KOD-Plus-Neo说明书克隆基因，反应体系为25 μL，包括distilled water 16 μL，10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 2.5 μL，2 mmol·L-1dNTPs 2.5 μL，25 mmol·L-1MgSO4 1.5 μL，上下游引物各0.75 μL，cDNA 0.5 μL，KOD-Plus-Neo 0.5 μL。采用三步法按如下反应程序进行扩增：预变性94℃ 2 min；变性98℃ 10 sec，退火65～0.5℃/cycle 30 sec，延伸68℃ 1 min，40循环；最终延伸72℃ 10 min ；4℃ forever。对反应产物1%琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段，与PMD18-T载体过夜连接[13]，连接产物转化大肠杆菌DH5α，并挑取单菌落PCR验证后过夜摇菌，送往生物公司进行测序。

1.4 细叶百合LpSVP基因序列及其蛋白质的生物信息学分析

对测序结果与细叶百合转录组数据库获得的SVP序列进行比对，利用NCBI在线软件Conserved Domains Search Service(CD Search)预测基因保守结构域，并利用BlastX[14]进行同源比对，利用DNAMAN[15]软件推测基因编码的氨基酸序列，并进行多序列比对，利用MEGA 5.0[14]构建系统进化树，利用ProtParam[16]预测氨基酸理化性质，利用TMHMM[16]预测蛋白质跨膜结构域，利用SignaIP[16]预测蛋白信号肽，利用ProtScale[16]预测蛋白亲/疏水性，利用WOLF PSORT[16]进行亚细胞定位预测，利用GOR4[16]预测蛋白质二级结构，利用SWISS-MODEL[16]对蛋白质三级结构建模分析。

1.5 细叶百合LpSVP基因时空表达特性分析

以lilyActin[17](GenBank 登录号：JX826390)基因作为内参，Rever Tra Ace®qPCR RT Kit反转录开花五个时期(花蕾Ⅰ期，花蕾Ⅱ期，花蕾Ⅲ期，花蕾末期和盛开期)总RNA，所得cDNA稀释5倍作为荧光定量模板，采用SYBR Green在Roche LightCycler96上进行如下反应：预变性(95℃ for 30 s)；3步法(95℃ for 5 s；60℃ for 15 s；72℃ for 30 s；40 cycles )；溶解(95℃ for 10 s；65℃ for 60 s；97℃ for 1 s)；冷却(37℃ for 30 s)。并利用2-ΔΔCt计算相对表达量，分析LpSVP基因对花不同发育时期的调控作用。同时提取叶片、花瓣、雄蕊、雌蕊、鳞茎总RNA，RT-PCR分析LpSVP基因组织特异性表达[18]。

2 结果与分析

2.1 细叶百合LpSVP基因的克隆

采用试剂盒提取的RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，完整性好，28S大约为18S的2倍，D260/D280介于1.8～2.0，通过特异性扩增后得到目的片段，测序后的拼接序列与转录组原始序列ORF比对吻合。该编码区大小为675 bp,预测编码224个氨基酸(图1)，具有高度保守的MADS区和半保守的K区(图2)，分别位于核苷酸序列的第4～234和第241～507处，属于MADS-box基因家族。基因登录号为MF693882。

图1 LpSVP的cDNA及其推测的氨基酸序列

2.2 细叶百合LpSVP序列同源性分析和系统进化树构建

在NCBI上通过BLASTX对LpSVP序列进行同源比对，发现该序列与台湾百合和麝香百合杂交品种(Liliumformosanum×Liliumlongiflorum)的SVP蛋白具有最高同源性，同源性达到99%，与荷花(Nelumbonucifera)、橡胶树(Heveabrasiliensis)、葡萄(Vitisvinifera)、咖啡树(Coffeaarabica)、猕猴桃(Actinidiachinensis)、芝麻(Sesamumindicum)、木薯(Manihotesculenta)SVP蛋白也具有较高的同源性，分别达到66%、67%、67%、67%、66%、66%、67%，并将LpSVP推测的氨基酸序列与这些物种的SVP蛋白进行多序列比对，一致性达到76.39%(图3)。

为进一步确定LpSVP进化关系，根据前人将拟南芥中MADS-box基因家族分成AGL15-like、AG、AGLClike、APl/FUL/CAL、SVP、SOC1、TT16、AP3 /PI、ANR1、FLC/MAF、AGLl2-like、SEP等12个进化枝构建系统进化树[19]，结果显示LpSVP基因与SVP聚为一类(图4)，从细叶百合中克隆得到的基因属于MADS-box中的SVP亚家族，命名为LpSVP。

2.3 细叶百合LpSVP蛋白特性分析

2.3.1 氨基酸理化性质分析 利用ProtParam[16]软件分析显示，LpSVP蛋白编码224个氨基酸，分子量为25.783 ku，理论等电点为5.62，分子式为C1112H1830N326O362S7，正负电荷残基总数分别为33和37，表示其在中性环境中带负电荷，其中谷氨酸含量最高，占12.1%，其次为亮氨酸(9.4%)和丝胺酸(8.9%)。

2.3.2 蛋白质亲/疏水性预测 利用ProtScale[16]预测蛋白的亲/疏水性，显示LpSVP蛋白在第165和第208位氨基酸残基处亲水性最强，最低值为-2.611；在第47位氨基酸残基处疏水性最强，最高为2.189，位于亲水区的蛋白占绝大多数，表明LpSVP蛋白为亲水蛋白。

2.3.3 蛋白质信号肽、跨膜结构域和亚细胞定位预测 信号肽是位于分泌蛋白的N端由15～30个氨基酸组成短肽链，指导分泌蛋白合成并在完成功能后被切除[20]。经预测LpSVP蛋白不含有信号肽，为非分泌性蛋白。

利用TMHMM[16]对蛋白跨膜结构域进行预测，LpSVP肽链位于膜外，推测其可能没有跨膜结构域，属于非跨膜蛋白。LpSVP发挥功能的部位可能在细胞核或细胞质中。

亚细胞定位预测显示LpSVP位于细胞核可能性为87.0 %，位于线粒体可能性为13.0 %，推测LpSVP蛋白可能定位在细胞核中，具体位置有待后续试验进一步证明。

2.3.4 蛋白质二级结构和三级结构预测 蛋白质多肽链通常盘曲和折叠成较为稳定的二级结构，以进一步完成活性功能域构象的构建，从而完成特定的生命活动。预测显示LpSVP蛋白二级结构有大量的a-螺旋136个(60.71%)，可能位于第6～39、62～69、83～132、136～141、143～173、200～206氨基酸残基处；随机卷曲65个(29.02%)，可能位于第1～5、40～42、49～53、56～61、70～82、133～135、142、174～178、185～199、207～214、224氨基酸残基处；延伸链23个(10.27%)，可能位于第43～48、54～55、179～184、215～223氨基酸残基处，总体上LpSVP蛋白为a-螺旋结构。三级结构预测蛋白以同型四聚体形式存在。

图2 LpSVP的保守结构域分析

注：APY23912.1：百合，XP_010254525.1：荷花，XP_021662492.1：橡胶树，XP_019073897.1：葡萄，AHW58026.1：咖啡树，AFA37967.1：猕猴桃，XP_020554864.1：芝麻，XP_021631111.1：木薯。

2.4 细叶百合LpSVP时空表达特性分析

2.4.1 细叶百合LpSVP在花发育过程中定量表达分析 选取细叶百合花发育5个阶段，即花蕾Ⅰ期、花蕾Ⅱ期、花蕾Ⅲ期、花蕾末期和盛开期(图5A)进行qRT-PCR分析。LpSVP基因在花发育过程中表达量呈现先增长后下降的趋势，在花蕾Ⅱ期表达量达到最大值，而后表达量一直下降，并在盛开期表达量降为最低(图5B)。

2.4.2 细叶百合LpSVP组织特异性表达分析 为进一步分析LpSVP在细叶百合不同部位的表达情况，提取鳞茎、叶片、花瓣、雄蕊、雌蕊各个组织RNA进行RT-PCR分析。结果发现，LpSVP基因在各个组织中都有表达，但表达量相对有差异，表达量从高到低分别为叶片、鳞茎、雄蕊、雌蕊、花瓣(图6)。

3 结论与讨论

在MADS-box转录因子家族中，SVP和AGL24具有最近的亲缘关系，两者同属于STMADS11亚家族[21]，但它们对花发育具有完全相反的调控作用，AGL24促进开花[4]，而SVP则抑制开花[9]，在花发育早期和AP1、CAL共同决定花分生组织的特异性[22]，且SVP和AP1，AGL24直接抑制B类和C类花同源基因的表达，从而抑制成花转变过程[22]。通过对细叶百合花发育过程定量表达分析，我们发现，从花蕾Ⅰ期到花蕾Ⅱ期LpSVP表达量显著增加，而从花蕾Ⅱ期到花蕾Ⅲ期，其表达量显著降低，表明它对此3个阶段的成花转变具有重要调控作用，且在花蕾Ⅱ期所行使的调控作用与其他几个花发育阶段相反。Li[23]等研究发现，拟南芥SVP-41突变体表现为早花型，而在突变体中导入枳PtSVP基因后，开花时间则推迟，J.H.Lee[24]等通过将大白菜BcSVP基因与拟南芥AtSVP启动子结合后转入拟南芥SVP突变体中也有类似发现，说明SVP在植物体内功能保守，且对开花时间延迟具有重要调控作用。自花蕾Ⅱ期后，LpSVP表达量一直降低，并在花朵发育完全(盛开期)时表达量最低，以减弱对花发育的抑制作用，响应植物开花进程。因此，在正常植物的花分生组织中必定存在抑制SVP过量表达的某种机制[25]，从而维持植株正常的开花时间。

图4 LpSVP蛋白系统进化树分析

注：a:花蕾Ⅰ期; b:花蕾Ⅱ期; c:花蕾Ⅲ期; d:花蕾末期; e:盛开期。

图6 LpSVP组织特异性分析

有研究表明，MADS-box在不同物种中会有不同程度的亚功能化和新功能化[26]。野生型拟南芥中，SVP基因在营养组织中表达量相似，在花原基中表达，但在花中不表达[9]。葡萄中SVP基因在营养器官和生殖器官中都表达，但在花中表达量相对较低[15]。Wu[27]等对猕猴桃时空表达研究发现，SVP基因仅在营养器官中表达，在花朵中并不表达。通过半定量分析发现，LpSVP在各个组织中均有表达，但表达量有强弱差异，从高到低依次为叶片、鳞茎、雄蕊、雌蕊、花瓣，这与前人的研究存在差异。不同物种、不同个体，甚至同一个体不同组织器官或不同SVP类基因，功能都有很大差异性，SVP基因既有保守性又有多样性[15]。

开花抑制基因突变体表现为早花型[9]，细叶百合LpSVP基因的克隆，为探讨SVP类基因对花发育分子调控机制奠定基础，同时为采用基因工程实现促成栽培和花期调控提供理论指导。