广西壮族颅内动脉瘤患者血管内皮素受体A基因rs6841581位点多态性观察

魏晓勇，叶子明，周瑜，秦超

(1武汉大学人民医院，武汉 430060；2广西医科大学第一附属医院)

颅内动脉瘤(IA)破裂所导致的蛛网膜下腔出血(SAH)是一种极为凶险的脑血管疾病，是脑卒中主要亚型之一[1]。研究[2]表明，人群中有2%～5%患有无症状性IA，其中约1/4的IA患者会发生SAH。约50%动脉瘤相关蛛网膜下腔出血(aSAH)患者死亡，另有25%遗留严重神经功能障碍[3]。目前认为种族、性别、遗传及一些获得性因素是IA形成和发展的危险因素。Alg等[4]发现，rs6841581是与IA相关性最稳定的单核苷酸多态性位点(SNP)之一。rs6841581位于常染色体4q31.23，在血管内皮素受体A(EDNRA)基因转录子(NM001957.3)5′端调节功能区域内。由于疾病易感基因在不同地域和种群间可能具有遗传差异，故仍需要对在不同种群中进行相关研究。目前，尚未见有EDNRA基因及其相关SNP位点与广西壮族IA相关性研究报道。本研究采用PCR-RFLP方法检测87例广西壮族囊状IA患者和111例健康查体对照者的EDNRA基因rs6841581位点基因型和等位基因频率分布，并对其进行比较。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年11月～2015年10月广西医科大学第一附属医院收治的囊状IA患者87例(观察组)，男31例，女56例；年龄(58.76±12.28)岁。均经全脑血管数字减影造影(DSA)检查确诊。单发IA患者70例，多发IA患者(IA数量≥2个)17例；共计107个囊状IA，其中位于颈内动脉48个、后交通动脉25个、大脑中动脉13个、大脑前动脉5个、前交通动脉12个、基底动脉4个。另选111例健康体检者作对照(对照组)，男45例，女66例；年龄(61.58±8.46)岁。均同期MRA排除IA。所有入选对象均来自广西壮族，同时排除颅内梭形动脉瘤、夹层动脉瘤、脑动静脉畸形。此研究经广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准，所有调查及抽血均获患者及家属同意并签署知情同意书。

1.2 EDNRA基因rs6841581位点多态性检测 ①DNA提取：抽取所有研究对象外周静脉血5 mL，使用磁珠法手工核酸提取试剂盒(Xiamen Zeesan Biotech Co.Ltd)提取外周血有核细胞DNA。②PCR扩增：1.引物设计：根据NCBI提供的DNA序列，由上海生物工程公司设计合成PCR引物。PCR特异性扩增产物长度为408 bp。2.PCR反应体系组成：Template 1 μL(第一轮为基因组DNA，第二轮为首轮PCR产物)，2×Es Taq MasterMix 10 μL，Primer F 0.5 μL，Primer R 0.5 μL，ddH2O 8 μL混匀，3 000 r/min瞬时离心后PCR仪扩增。3.巢式PCR反应条件：预变性94 ℃、5 min，随后进行第一轮循环20个周期，第二轮循环35个周期的变性94 ℃、30 s，复性60 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，再延伸72 ℃、10 min。4.PCR产物电泳检测：使用1%琼脂糖凝胶(Agarose LE)置于0.5×TBE电泳液在100 V恒压下水平电泳30 min，检测是否有特异性的扩增产物。③RFLP分析：取PCR产物0.5 μL，10×Buffer R 1 μL，Eco72Ⅰ内切酶(10 U/μL)0.5 μL，ddH2O 8 μL，混匀，3 000 r/min瞬时离心，37 ℃、15 min，80 ℃、10 min酶切。取5 μL酶切产物加入2%琼脂糖凝胶加样孔中，置于0.5×TBE电泳液并在120 V恒压下水平电泳30 min后取出，放置在紫外光凝胶成像系统下观察带型。④DNA测序检验：从受试对象中随机抽取AA、AG、GG三种基因型各15例PCR产物样本，使用Sanger双脱氧链终止法测序检验(3730XL测序仪)。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计数资料比较采用Pearson′sχ2检验及Fisher确切概率法检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR-RFLP反应产物电泳及基因型判定 PCR产物在紫外光凝胶成像系统下显示为408 bp的单一条带。PCR产物经Eco72Ⅰ限制性内切酶消化后，电泳检测结果为rs6841581纯合子型(G/G)显示为252、156 bp两根条带。纯合子型(A/A)显示为408 bp一根条带。杂合子型(A/G)显示为408、252、156 bp三根条带。随机选取三型PCR产物各10份行Sanger双脱氧链终止法DNA测序，结果与PCR-RFLP基因型判定一致。杂合子(A/G)基因型在该SNP位点显示为A/G双峰。

2.2 两组基因型和等位基因频率分布 结果见表1。

表1 两组基因型和等位基因频率分布(例)

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3 两组不同性别入选对象基因型和等位基因频率分布 结果见表2。

表2 两组不同性别入选对象基因型和等位基因频率分布(例)

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.4 观察组IA单发、多发者基因型和等位基因频率分布 结果见表3。由表3可知，单发IA和多发IA EDNRA基因rs6841581位点的基因型、等位基因频率分布比较无显著性差异。

表3 观察组IA单发、多发者基因型和等位基因频率分布(例)

3 讨论

Vernooij等[5]认为，IA具有明显的家族聚集性，超过20%IA患者具有家族史。Brown等[6]使用MRA筛查报告家族性IA患者一、二级亲属中IA患病风险为8.7%～13.0%，远高于普通人群患病率。许多遗传性结缔组织病，包括常染色体显性遗传多囊肾疾病、Ⅰ型神经纤维瘤病、马凡综合征等也与IA形成有关[7]。根据IA家族聚集性特点及其与遗传性结缔组织病的联系，可推断遗传因素在IA发生发展过程中可能扮演重要角色。本研究发现，观察组EDNRA基因rs6841581位点三种基因型(AA/AG/GG)频率及等位基因(A/G)频率分布与对照组比较均无统计学差异，而在隐性遗传模式下纯合子GG基因型在观察组中的频率显著高于对照组，提示EDNRA基因rs6841581位点可能与广西壮族人群IA相关，纯合子GG基因型可能是易感基因型。

以往文献报道，不同地区、种群间aSAH发病率存在显著差异。研究[8]认为，中国北京汉族人群发病率较低(2.0/10万)。文献[9]报道，芬兰和日本是aSAH高发地区，发病率分别为19.7/10万和22.7/10万。荷兰、芬兰和日本人群GWAS研究均证实EDNRA基因rs6841581位点与IA相关，且等位基因G为易感基因[10]。EDNRA基因与中国汉族人群散发IA相关性研究也表明，rs6841581等位基G携带者患IA风险较等位基因A高，纯合子GG携带者患病风险是纯合子AA的2.85倍[11]。IA的组织学特点主要为动脉血管壁的局部完整性受损，包括血管内皮功能异常、内膜增生、细胞成分的消亡及细胞外基质的紊乱等[12]。血管内皮素是血管壁损伤后组织重塑过程中的强烈收缩剂。EDNRA是一种主要存在于血管平滑肌细胞，包括脑血管、心脏、肾脏及神经元等在内的G蛋白偶联受体，具有调节内皮素主要的同工型-EDN1的血管收缩及有丝分裂的作用。EDNRA通过加快细胞周期进程和增殖来调节内皮素1的有丝分裂效应。血管内皮素信号在血管壁受损的地方被迅速激活可能有利于促进内皮细胞修复损伤。基因功能研究表明，EDNRA基因rs6841581位点的等位基因G可使EDNRA基因转录下调[13]。EDNRA转录下调可抑制EDN信号，干扰血管损伤的修复过程，限制血管祖细胞的活动而导致修复缺陷，进而可能促使IA形成和发展[10]。

本研究显示，观察组女性基因型、等位基因频率分布和对照组比较无显著差异。观察组男性等位基因G频率显著高于男性对照组，提示SNPrs6841581等位基因G与广西壮族人群男性IA患者相关。Nguyen等[14]流行病学研究发现，女性IA患病率高于男性，认为女性是IA的主要危险因素之一。女性患者动脉瘤扩大的风险是男性的1.26倍[15]。在不同年龄段中，女性aSAH患者发病率均高于男性，女性占IA相关SAH患者的比重也随年龄增高而增大，女性易感IA的原因可能与内分泌等因素有关，性激素受体在血管内广泛存在，除直接作用外还可能通过对脂肪代谢和凝血功能的影响产生作用。女性绝经后体内雌激素水平下降， 可使组织内胶原蛋白含量降低， 从而导致血管壁强度降低，在血流作用下促使局部血管壁扩张而形成IA。由于女性额外具有的IA风险，使得 SNPrs6841581等位基因G作用对女性IA形成和发展的影响比重降低。这也可能是导致本研究中女性IA患者多于男性，而女性与SNPrs6841581相关关系却呈阴性结果的原因。

本研究观察组中多发IA患者17例，占IA患者总人数 19.5%，低于文献[16]报道的27.9%。多发IA常分布在两侧脑动脉，特别是在两侧颈内动脉及大脑中动脉上。多发IA的年破裂率为 6.8%，而单发IA的年破裂率仅为1．9%。学者认为多发性颅内动脉动脉瘤在青少年IA患者中更为常见，相对于单发IA，多发IA可能与家族性IA及先天血管发育不良性IA更为相关[17]。两种不同IA亚型特征提示它们的形成和发展机制以及易感基因位点多态性可能存在差异。本研究对单发IA患者和多发IA患者两个亚组的EDNRA基因rs6841581位点基因型及等位基因频率分布进行了相互比较，未发现该位点基因型和等位基因频率在两个IA患者亚组间有显著性差异。造成这种结果的原因，可能由于IA是一种复杂基因遗传病，EDNRA基因rs6841581位点基因型及等位基因频率分布对广西壮族IA人群的单、多发IA分型影响较小，也可能是由于总体样本量偏少且分组后两个IA亚组的人数较为悬殊，造成了统计学偏差。EDNRA基因rs6841581位点多态性与单发IA和多发IA亚组分型的关系还需进一步研究。

总之，广西壮族人群IA患者存在EDNRA基因rs6841581位点多态性，GG基因型可能是IA的易感基因型。