2016年中国部分地区白斑综合征病毒高变异区序列的分析比较

蔡 苗，孙新颖，刘庆慧，万晓媛，黄 倢

（1.青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，农业部海水养殖病害防治重点实验室，青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 266071；2.水产科学国家级实验教学示范中心，上海海洋大学，上海 201306；3.济南大学前沿交叉科学研究院，济南 250022）

对虾养殖作为水产品养殖行业中的重要的组成部分，其发展面临着水质、气候以及滥用药物等一系列问题的威胁，但最主要的还是病害问题，近年来这一问题也呈现出日益严重的趋势［1－3］。白斑综合征病毒 （white spot syndrome virus，WSSV）是对虾养殖行业中存在的主要病原之一，自从20世纪90年代首次爆发以来，引起了全球对虾养殖产业的广泛关注，同时也对全世界各地的对虾养殖业带来了巨大的经济损失［4］。白斑综合征病毒是一类无包涵体的具囊膜、一端有尾巴状结构、杆状的双链环状DNA病毒［2］，大小约为300 kb，感染后在数天内死亡率可达100%［5］。2005年国际病毒分类委员会第7次报告提出把 WSSV归入到线形病毒科（Nimaviridae）白斑病毒属（Whispovirus），它是此新科中唯一的成员［6］。迄今为止，GenBank上共公布了7个WSSV基因全序列，研究最多的分别有中国大陆株（WSV-CN，KT995472）、中国台湾株（WSSV-TW，AF440570）和泰国株（WSSV-TH，AY753327），其中泰国株具有目前最大的基因组312 kb，被假定成为祖先株［7］。通过基因组全序列比对发现这3个毒株的基因组序列有约99%的核苷酸保持一致性，存在的主要的差异分别是：1）大片段序列插入／缺失；2）易于发生基因重组的变异区；3）开放性阅读框（open reading frames，ORFs）内出现的重复单元变化差异（variable number tandem repeat，VNTR）；4）转座酶基因序列存在与否；5）单核苷酸的缺失、插入及 多 态 性 （single-nucleotide polymorphisms，SNPs）［8－9］。目前应用于 WSSV流行病学研究的主要有 ORF14／15和 ORF23／24的缺失变化，ORF75、ORF94和 ORF125的 VNTR及SNPs［10－12］。有研究表明，在可变区 ORF14／15和ORF23／24上出现的大片段缺失情况与地理位置有关［11］，其中可变区 ORF14／15通过重组逐步形成，而可变区ORF23／24常出现大片段缺失；在ORF75上有两种重复单元（repeat units，RUs），分别为 45 bp和 102 bp，在第 3、15、30、40、42、44和83个碱基处存在多态性；ORF94上的RUs大小为54 bp，在48位有多态性；而ORF125上的RUs有69 bp，第1、2和倒数第 1个重复单元有其特有的SNP，从第3到倒数第2个重复单元在第 8、18、25、66和 69位碱基具有多态性［9，11］。在之前有关WSSV流行病学的研究中大多只涉及到重复单元的数量，然而对于每个重复单元都可能存在单核苷酸的缺失、插入及多态性。因此仅仅考虑重复单元的数量而忽略单核苷酸多态性则可能得不到理想的流行病学调查结果。

本实验选取2016年1－7月从中国部分地区采集到的47份WSSV阳性样本，通过特定引物对目的片段进行扩增，继而进行测序并分析比较不同地区样本的ORF14／15和ORF23／24序列缺失情况，ORF75、ORF94和 ORF125的 VNTR及SNPs变化情况，并以此来探讨WSSV不同毒株间的遗传进化差异，以期为WSSV分子流行病学研究提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 样本来源

本实验室于2016年1－7月WSSV病害爆发期间，在山东、河北和浙江3省采集到47份患病样本，所有实验样本采集后均置于－80℃的冰箱冷冻保存。样本信息见表1。

1.2 病毒核酸提取

取约30 mg鳃组织，进行DNA提取，提取产物置于－20℃备用。

1.3 PCR检测

按照 GB／T 28630.2－2012白斑综合征（WSD）诊断规程第2部分套式PCR检测法对DNA样本进行WSSV检测。而后通过1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。

1.4 目的基因扩增

将1.3中检测呈WSSV阳性的样本通过特定引物进行扩增，采用25uL的体系：10×PCR反应缓冲液（含 Mg2＋）2.5μL，双蒸水 17.3μL，dNTP 2μL，正向与反向引物各 0.5μL，Ex Taq DNA聚合酶0.2μL，WSSV模板1μL。PCR扩增中使用的引物与反应条件见表2。

1.5 目的基因克隆及片段分析

将1.4中的阳性PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化后与载体 pMD18-T连接、转化至TOP10感受态细胞，在LB肉汤培养液中37℃振荡含1 h复苏抗性。然后涂在含有氨苄青霉素的平板培养基上，37℃过夜培养。每个平板挑取至少5个单菌落接种于添加氨苄青霉素的LB肉汤培养液中37℃振荡4 h，取培养物为模板按1.4方法进行鉴定。将PCR鉴定为阳性的菌液全部送到上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA双向测序。测序结果用DNAMAN 8软件进行序列比对分析，ORF14／15和ORF23／24片段分别与泰国株（TH-96-II）和中国台湾株（TW）比对［13］，分析序列缺失情况；ORF75、ORF94和ORF125测序结果进行VNTR以及SNPs分析［12］。

2 结果与分析

2.1 套式PCR结果

WSSV病害暴发区采集到47份样本中，共有33份样本在第1轮扩增中呈现WSSV阳性，其余14份样本均在第2轮扩增中呈现阳性。

表1 样本采集信息及ORF75、ORF94和ORF125重复单元数目Tab.1 Samples information and repeat units（RUs）present in ORF75，ORF94 and ORF125

表2 PCR扩增引物以及反应条件Tab.2 PCR primers and cycling conditions

2.2 目的基因扩增结果

在WSSV样本扩增中有23份样本（2#、5#、6#、7#、8#、9#、10#、13#、15#、17#、19#、34#、35#、36#、37#、38#、39#、40#、41#、42#、43#、44#、45#）出现ORF14／15的目的条带，成功扩增样品比率为48.94%，其中13#、15#和19#样本的目的条带与其它条带相比片段明显大，山东滨州、河北秦皇岛和浙江宁波、湖州地区样本未有阳性条带出现（图1）。而在ORF23／24扩增中，有10份样本（6#、13#、19#、28#、29#、34#、35#、36#、40#、41#）有目的条带检出，检出率为21.28%，条带大小相差不明显，山东青岛、滨州和浙江宁波、湖州地区的样本均未检出（图2）。在ORF75扩增中，除了山东青岛、滨州，河北黄骅、秦皇岛和浙江宁波、湖州的样本外，共有 8份样本（13#、15#、19#、34#、35#、36#、40#、41#）出现相应的阳性条带，检出率为17.02%，13#、15#、19#样本目的条带较之其它条带偏大（图3）。在ORF94扩增中，有13份样本（12#、13#、14#、15#、16#、18#、19#、25#、39#、40#、41#、42#、45#）出现相应目的条带，山东青岛、滨州，河北黄骅和浙江湖州样本未检出，检出率为27.66%（图4）。在ORF125扩增中，共有20个样本（6#、13#、14#、15#、16#、18#、19#、28#、29#、30#、31#、34#、35#、36#、37#、38#、39#、40#、41#、42#）检出，检出率为42.55%，而山东青岛、滨州和浙江湖州的样本未检出（图5）。

图1 ORF14／15的扩增结果Fig.1 Amplification result of ORF14／15注：M：DNA Maker DL 2000；（＋）阳性对照，（-）阴性对照；1～47：样本编号Note：M：DNA Maker DL 2000；（＋）positive control，（-）negative control；1～47：number of samples

图2 ORF23／24的扩增结果Fig.2 Amplification result of ORF23／24注：M：DNA Maker DL 2000；（＋）阳性对照，（-）阴性对照；1～47：样本编号Note：M：DNA Maker DL 2000；（＋）positive control，（-）negative control；1～47：number of samples

图3 ORF75的扩增结果Fig.3 Amplification result of ORF75注：M：DNA Maker DL 2000；（＋）阳性对照，（-）阴性对照；1～47：样本编号Note：M：DNA Maker DL 2000；（＋）positive control，（-）negative control；1～47：number of samples

图4 ORF94的扩增Fig.4 Amplification of ORF94注：M：DNA Maker DL 2000；（＋）阳性对照，（-）阴性对照；1～47：样本编号Note：M：DNA Maker DL 2000；（＋）positive control，（-）negative control；1～47：number of samples

图5 ORF125扩增Fig.5 Amplification of ORF125注：M：DNA Maker DL 2000；（＋）阳性对照，（-）阴性对照；1～47：样本编号Note：M：DNA Maker DL 2000；（＋）positive control，（-）negative control；1～47：number of samples

2.3 序列比对

在ORF14／15扩增中，共得到4种大小不同的片段，即1 260 bp（山东青岛、河北黄骅）、1 270 bp（河北黄骅、唐山、沧州）、1 850 bp（河北唐山）和2 660 bp（山东日照、河北沧州），通过与该片段最为完整的TH-96-II（AY753327）进行序列比对，分别缺失 6 540 bp、6 530 bp、5950 bp和5 140 bp（图6）。在ORF23／24扩增中共得到3种片段，分别是1 137 bp（河北黄骅、山东日照）、1 140 bp（河北沧州、秦皇岛）和1 265 bp（河北唐山），同此段区域最完整的中国台湾株［TW（AF440570）］进行序列比对，缺失长度分别为12 073 bp、12 070 bp、11 945 bp（图7）。

图6 WSSV不同毒株ORF14／15序列比对Fig.6 Sequence alignment of ORF14／15 in different WSSV strains注：KR：韩国株（JX515788）；TH：泰国株（AF369029）；TW：中国台湾株（AF440570）；CN：中国株（AF332093）.两侧的矩形表示扩增出的序列，括号内数字表示扩增出片段的大小，中间的虚线表示与TH-96-II毒株序列比对缺失的序列Note：KR：South Korean plant（JX515788）；TH：Thai strain（AF369029）；TW：China Taiwan strain（AF440570）；CN：China plant（AF332093）.Rectangles indicate sequences amplified by ORF14／15，figures in the bracket indicate the length of the amplified fragments，the dotted lines indicate sequences deletions compared with the TH-96-II strain

图7 WSSV不同毒株ORF23／24区域的序列比对Fig.7 Sequence alignment of ORF23／24 in different WSSV strains注：两侧的矩形表示扩增出的序列，括号内数字表示扩增出片段的大小，中间的虚线表示与TW毒株序列比对缺失的序列Note：Rectangles indicate sequences amplified by ORF23／24，figures in the bracket indicate the length of the amplified fragments，the dotted lines indicate sequences deletions compared with the TW strain

在ORF75扩增中，出现了4种大小不一的片段，分别为2 503 bp、2 310 bp、2 341 bp和 1 739 bp，将片段与重复单元比对可知，RUs数目分别为11（山东日照）、8（山东日照）、10（河北沧州）、3（河北唐山）（图8）。ORF94扩增中，共扩增出5种片段，分别为 590 bp、698 bp、749 bp、916 bp、1 078 bp，RUs数目分别为 5（河北秦皇岛）、7（河北沧州、唐山）、8（山东日照）、11（浙江宁波、山东日照）、14（山东日照、河北唐山）（表 1）。VNTR和SPNs分析显示，含有5个RUs的ORF94片段在48位的碱基为 T、T、T、T、T，含有 7个 RUs的ORF94在48位的碱基为 T、G、G、G、G、T、T，含有8个RUs的ORF94片段在48位的碱基为T、T、T、T、T、T、T、T，含有 11个 RUs的 ORF94片段在48位的碱基为 T、T、T、T、T、T、G、T、G、T、T，而含有14个RUs的ORF94在48位的碱基为T、T、T、T、G、G、T、G、G、T、T、T、T、T（表 3）。在 ORF125扩增中，共得到3种不同的片段，分别为652 bp、721 bp和790 bp，RUs数目分别为4（山东日照、河北唐山）、5（河北黄骅、沧州、秦皇岛、唐山）、6（山东日照、浙江宁波、河北沧州、唐山）。在ORF125的所有VNTR类型中，不考虑3个特殊RUs，结果显示所有类型在8、18、25、66和69位置的碱基均为 G、G、G、G和 A；而在 9、50、53、61和63位碱基上出现了4种变异（表4）。

图8 ORF75区域RUs情况Fig.8 The RUs of ORF75 region注：黑长方体代表45 bp的重复单元，红长方体代表102 bp的重复单元Note：The black cubes represent 45 bp RUs and the red cubes represent 102 bp RUs

表3 ORF94区域各重复单元在48位的单核苷酸多态性Tab.3 Single-nucleotide polymorphisms（SNPs）patterns at position 48 of ORF94 region

表4 ORF125区域各重复单元在9、50、53、61和63位点的单核苷酸多态性Tab.4 Single-nucleotide polymorphisms（SNPs）patterns at position 9，50，53，61 and 63 of ORF94 region

3 讨论

本研究取用2016年1－7月从我国3省9市包括山东的青岛、日照和滨州，河北的黄骅、沧州、秦皇岛和唐山，浙江的宁波和湖州的发病地区采集到的47份WSSV阳性样本，以特定的引物扩增目的片段，通过测序分析不同样本的缺失及变异情况。序列比对结果显示，在开放阅读框ORF14／15的扩增中，分别有6 540 bp、6 530 bp、5 950 bp和5 140 bp的片段缺失，最大程度的缺失为6 540 bp，出现在山东青岛、河北黄骅地区的样本中，本实验室孙新颖等［14］在研究中发现，河北黄骅、曹妃甸、浙江温州和广东江门地区的样本也出现相同的缺失片段；河北黄骅、唐山、沧州的样本得到了缺失6 530 bp的片段，本实验室孙新颖等［15］在2013年和2014年的样本中均得到相同的缺失情况；本实验中河北唐山样本中出现了缺失程度为5 950 bp的片段，这与TANG等［16］对于马达加斯加岛、莫桑比亚和查特阿拉伯地区毒株的实验结果一致，HOA等［17］对印度和越南南部地区毒株的调查中也出现了同样的结果。山东日照和河北沧州样本扩增中得到了最大片段，长度为2 660 bp，缺失片段为5 140 bp，与中国台湾株（TW）仅仅相差两个碱基。

在ORF23／24扩增中，共得到3种PCR扩增产物，分别为1 137 bp、1 140 bp和1 265 bp，1 137 bp片段与1 140 bp片段相比，保留了9个碱基的一段GATTTCATC序列，而缺少12个碱基的一段AGAGGAAGAAGA序列。已报道中国台湾株（TW）的ORF23／24片段最为完整，因此通常将ORF23／24与TW进行比对。目前，已知泰国株具有最大的缺失片段为13 120 bp，韩国株缺失程度居中，为5 654 bp，而中国株缺失片段最小，仅1 169 bp。本研究中出现的3种缺失情况，分别为 12 073 bp、12 070 bp、11 945 bp，均属于较大程度的片段缺失，其中12 070 bp的缺失片段也分别出现在2013年和2014年的样本中［14－15］。在MARKS等［18］和 ZWART等［19］的研究中发现缺失大片段后保留的短片段在复制时往往具有优势，可能与自身的毒力有关。

在各地区样本的ORF75中，重复单元数目差异比较明显，而相同地区样本之间也存在差异，例如同样是山东日照样本，RUs数目存在11和8两种情况；河北唐山样本所含的RUs数目最少，仅为3，这也在同年安徽池州的克氏原螯虾（Procambarus clarkii前国内外报道的最小的ORF75 RUs组合，该组合为102 bp、45 bp和45 bp，与安徽池州的克氏原螯虾的3RUs一致，其它地区样本ORF75 RUs组合均以45 bp、102 bp和45 bp开始，这与大多已报道的毒株结果类似［20－23］；从图 8可以看出，某些 RUs的位置存在保守性，相似片段可能是由于变异得到。

在ORF94扩增中，河北秦皇岛的样本得到了最小的片段，为590 bp，有5个 RUs，最大片段1 078 bp中有14个RUs，这表明相同地区样本中的RUs也有差异。HOA等［17］在对印度和越南的WSSV毒株的研究中发现病害爆发区的WSSV ORF94 RUs数目大多都小于 8。MARKS等［18］发现携带多种变异毒株的宿主，经过繁殖1～2代，大多只能检测到基因组小的毒株，因此推测RU数目少的WSSV更容易在传播过程中存活而保留下来［20］，这与之前提到的关于 ORF23／24缺失大片段后保留的短片段在复制时往往具有优势的结论一致。

在ORF125扩增中，共有3种片段，RUs数目为 4、5、6，已有的报道显示，WSSV ORF125 RUs的第 8、18、25、66和 69位点存在 SNPs［13，22］，而本实验中所有样本在8、18、25、66和69位置的碱基均为 G、G、G、G和A，而在9、50、53、61和63位碱基上出现了SNPs。TANG［16］在2013年的研究中发现，ORF75的重复单元数目相同；而大多数样本均出现ORF94序列缺失，仅有极个别样本出现了数目不等的RUs；ORF125的RUs数目也存在差异。MUSTHAQ等［12］和 WAIKHOM等［23］的实验表明，ORF94在不同宿主中存在一定程度的VNTR。然而 GUDKOVS等［10］研究 中 发现，ORF94的 RUs没有任何差异。SINDHUPRIYA等［24］的实验表明，ORF94的 RUs存在细微的差异，而ORF75和ORF125不存在VNTR。因此仅仅考虑重复单元的数量的差异（VNTR）而忽视单核苷酸多态性（SNPs）则可能得不到理想的流行病学调查结果。通过增加SNPs的分析则有助于进一步区分具有相同VNTR的毒株。在本实验中，不同地区的样本的ORF94和ORF125均存在VNTR，SNPs的分析结果则进一步显示出样本之间的差异性。

本研究结果表明，2016年的样本中，WSSV毒株存在一定程度的变异情况，其中ORF14／15和ORF23／24均出现了新的缺失片段，ORF75、ORF94和ORF125的VNTR以及SNPs变化情况也存在明显差异，但总体较2013年和2014年的样本表现出部分稳定性。因此可以推测，WSSV毒株的不断变异是为了更好地适应环境，但变异是否导致WSSV致病性的变化以及变化机制还有待进一步研究。