新疆巴州焉耆盆地奶牛布鲁氏菌病病原学分离鉴定情况报告

帕提古丽·托乎提，莫合塔尔·阿布力孜，颜成旭，曾泽民*

（1.新疆巴州动物疾病控制与诊断中心，新疆 库尔勒 841000；2.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，乌鲁木齐 830001）

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌杆菌引起的人畜共患的传染－变态反应性疾病。本病具有宿主广泛、传染性极强、死亡率不高以及感染后根治困难等特点，是危害最大的人畜共患病之一[1]。目前在家畜中牛、羊、猪最常发生布鲁氏菌病，亦可感染人，严重威胁着人类和动物健康。牛、羊、猪等布鲁氏菌病感染病畜的组织、尿、乳、产道分泌物、羊水、胎盘及胎儿等具有传染性[2]。

为了对新疆巴州地区奶牛布鲁氏菌病病原进行分析研究，在焉耆盆地收集奶牛流产胎儿、屠宰病料、阴道分泌物、鲜乳等病料进行布鲁氏菌的分离培养，鉴定引起牛布鲁氏菌病的菌种及其生物型，确定焉耆盆地引起奶牛感染布鲁氏菌的优势菌种及其生物型。

焉耆盆地的焉耆县、和静县、博湖县、和硕县四县的奶牛血清学监测调查出现布鲁氏菌病阳性奶牛的养殖场和散养奶牛户共收集奶牛流产胎儿57份。按常规布鲁氏菌分离培养法进行布鲁氏菌分离培养，并对分离出的疑似布鲁氏菌的菌株按照国际布鲁氏菌鉴定标准进行菌种及其生物型鉴定，研究了该区域奶牛感染布鲁氏菌病的优势菌种及其生物型。研究结果显示，焉耆盆地奶牛布鲁氏菌病的优势菌种为牛种布鲁氏菌生物3型。

1 材料与方法

1.1 布鲁氏菌分离培养

从病畜体内组织病料中分离出的布鲁氏菌仍是确定布鲁氏菌病最可靠的证据。布鲁氏菌多寄生于网状内皮系统，脾脏出菌率最高，肝脏与肾脏次之[3]。

1.2 布鲁氏杆菌细菌培养材料的制备

配制布鲁氏杆菌细菌培养基：用国标培养布鲁氏菌病的普通布鲁氏菌培养基；

布鲁氏菌Tb噬菌体：中国疾病预防控制中心提供；

布鲁氏菌抑菌染料硫堇复红：巴州动物疾病控制与诊断中心配制；

单相血清A、M、R：中国疾病预防控制中心提供；

布鲁氏菌病诊断抗原：由哈尔滨兽医研究所生产，批号：201007；

布鲁氏菌病诊断阳性血清：由哈尔滨兽医研究所生产，批号：201003。

1.3 布鲁氏菌的培养

从流产胎儿组织中分离布鲁氏杆菌，取流产胎儿，先用清水把泥土等污物洗净，然后在3%来苏尔中浸泡20～30 min，在无菌条件下解剖，分别取肝、脾、肾、淋巴结、胃内容物、肺、心，在无菌条件下接种在布鲁氏菌专用固体培养基上，每份样品各接种2支培养基，置37℃恒温箱内培养，分大气环境和CO2环境培养。4～5 d后观察结果，如未发现布鲁氏菌生长，可继续培养观察2周。如有可疑细菌生长，可把菌落转移，48 h纯化培养，进行生物型鉴定。

1.4 布鲁氏菌的鉴定

布鲁氏菌的鉴定，首先要确定可疑菌是否是布鲁氏菌，如果是布鲁氏菌，再进一步鉴定种和型。

1.4.1 常规确定布鲁氏菌属的方法

布鲁氏菌的鉴定，先把分离培养后挑取的可疑菌做革兰氏染色镜检，如具备以下条件，则可初步确定为布鲁氏菌。

一是从菌落生长时间和形态观察：布鲁氏菌在普通培养基上不宜生长，在布鲁氏菌专用培养基上接种4～5 d或更长时间，培养出来的菌落大小不等，菌落呈湿润、圆形、稍隆起，菌苔半透明。小球杆菌或小短杆菌，多为单个，很少成双，链状排列。

二是从血清凝集试验观察：布鲁氏菌培养物与布鲁氏菌血清作凝集试验（玻片凝集和试管凝集）呈阳性。

1.4.2 布鲁氏菌菌种及其生物型鉴定方法

1.4.2.1 初代分离培养时二氧化碳的需求 被检流产胎儿组织病料接种在培养基上培养，每份样品培养2个试管，1份放在干燥缸内，里面点燃蜡烛密封，蜡烛灭火可产生5%～10%的二氧化碳，另一份接种样品培养试管放在普通环境中，37℃培养，分离到布鲁氏菌菌株。

1.4.2.2 硫化氢产生量的测定 将待检菌的48 h培养物接种在琼脂斜面上，将醋酸铅滤纸条夹于斜面与管壁之间，使滤纸条和斜面保持平行，以不接触斜面为易。滤纸条留在管外1～2㎝，置37℃温箱培养，经2、4、6 d各观察一次，以毫米计算滤纸条变黑长度，产生中等量的硫化氢，滤纸条变黑部分长度5～8㎜。

1.4.2.3 染料抑菌试验 将待检菌48 h培养物接种在pH值6.8的琼脂平皿上，用蜡笔将平皿分隔呈4～6格，每格接种一株菌，把不同浓度的硫堇、碱性复红放在每格培养基上。37℃培养，2、4、6 d各观察一次。如布鲁氏菌被抑制则有菌落或菌苔生长。

1.4.2.4 单相特异性血清A、M凝集试验 玻片凝集试验：在清洁无油脂玻片上各滴一滴A、M、R血清，在另一端再滴一滴生理盐水，然后用接种环取少许布鲁氏菌培养物，在生理盐水中研磨制成菌悬液，取菌悬液分别加入A、M、R血清中混匀，在1～2 min出现凝集颗粒为阳性，否则为阴性。试管凝集试验：将待检菌制成抗原，然后按试管凝集反应操作程序分别与A、M、R血清做试管凝集反应，观察A、M、R血清凝集程度的差别。

1.4.2.5 噬菌体裂解试验 采用倾注法，将增殖菌比浊成每毫升10亿菌体，取0.2 mL加到溶化的并50℃～56℃水浴保温的半固体培养基中，然后倾注到底层为布鲁氏菌琼脂培养基上。待凝固后，将各种稀释度的细菌体滴至不同位置上，干后放37℃温箱中培养24～48 h观察，在观察中如果在噬菌体处出现透明的噬菌斑即为裂解，否则为不裂解。

1.4.2.6 尿素酶活性试验 待检布鲁氏菌48 h培养物，用灭菌生理盐水制成每毫升10亿菌体的菌悬液，取1 mL轻轻加到尿素酶培养基上，37℃培养，15 min、30 min，1 h、2 h、6 h和14 h各观察一次。如培养基由黄变成红色或紫红色表示尿素被分解，判定为阳性。

2 结 果

焉耆盆地收集的57份奶牛流产胎儿按常规布鲁氏菌分离培养法进行布鲁氏菌分离培养，经鉴定分别在焉耆县收集的奶牛流产胎儿脾脏组织病料培养出来24号1株菌、和静县收集的牛流产胎儿肺脏组织病料中分离到14号1株菌、博湖县收集的奶牛流产胎儿脾脏组织病料中分离到59号1株菌共3株菌株，鉴定出为牛种布鲁氏菌生物3型。焉耆县收集的奶牛流产胎儿肝脏组织病料中分离到的32号1株菌为羊种布鲁氏菌生物2型，见表1。研究结果显示，焉耆盆地奶牛布鲁氏菌病的优势菌种为牛种布鲁氏菌生物3型，主要监测出于焉耆盆地的焉耆县、和静县、博湖县。

3 预防控制措施

奶牛养殖户人畜共患病防护意识淡薄、牲畜调运频繁、运输环节监管困难，对阳性牛扑杀、无害化处理措施不到位等原因病畜持续感染家畜，引起人的布鲁氏菌病[6]。为了布鲁氏菌病的预防和控制，我们要采取以下有效措施：

表1 奶牛分离菌株布鲁氏菌种及其生物型的鉴定标准及鉴定结果

加大宣传力度。以通俗易懂的防病科普教育，让广大养殖户充分了解布鲁氏菌病对人健康的危害，加强对兽医工作者的技术培训，提高农牧民养殖户的自我保护防范能力[7]。

强化卫生、做好消毒管理。养殖场严格按卫生要求处理流产物、粪便及污染物，切断病源传播途径。奶牛饲养场的金属设施设备、圈舍、场地、车辆要定期消毒，注意母畜产前消毒。

定期检疫净化，彻底地扑杀阳性畜，消除传染源，切断传播途径，培育健康牛群[8]。

做好活畜交易市场的管理和检疫[9]。

运输检疫监督对运输奶牛要严把检疫监督关，在购牛时必须从非疫区健康牛群中选择[10]。

增加经费投入，确保防控经费到位，使防控扑杀无害化处理工作能够顺利开展[11]。

4 讨 论

巴州地区奶牛主要分布于焉耆盆地。我们对焉耆盆地的奶牛布鲁氏菌用布鲁氏菌常用国际鉴定方法进行分离鉴定。研究结果显示，焉耆盆地引起奶牛布鲁氏菌病的优势菌种为牛种布鲁氏菌生物3型。新疆农业大学对兵团十二师奶牛场布鲁氏菌分离菌株用VirB8-PCR方法扩增布鲁氏菌的VirB8基因进行鉴定，鉴定出布鲁氏菌，同时采用布鲁氏菌分子分型PCR方法进一步对分离株鉴定，鉴定出牛种布鲁氏菌[4]。随着各种分子生物学、蛋白和基因工程技术的发展，布鲁氏菌的研究不断深入，其病原学研究必将获得长足发展[5]。