喹诺酮类胶体金检测试剂板的研发及在水产品中的应用

谢世红，王伟萍，孟 霞，胡叶军，陈笑笑，银旭红，刘 彬

(1.江西省水产技术推广站，江西南昌 330046； 2.杭州南开日新生物技术有限公司，浙江杭州 310051)

喹诺酮类药物(guinolones，简称QNS)是继磺胺药之后迅速发展起来的一类十分重要的人工合成抗菌药物，因其具有抗菌谱广、组织穿透力强、高效低毒、价格低廉等优点，被广泛用于动物的多种感染性疾病的预防和治疗[1]。该类药物在动物体内消除缓慢，过量或不当使用会造成动物产品中残留和蓄积，人类长期食用含有喹诺酮类药物残留的水产、禽畜肉及禽蛋等动物源性产品后，可能导致细菌耐药性问题，以及对中枢神经系统造成不良反应[2-3]。

鉴于氟喹诺酮类药物在食品中残留对人类健康的危害，食品添加剂联合专家委员会(JCEFA)制定了达氟沙星在牛、猪、禽的最高残留限量(MRLs)；欧盟委员会制定法规规定了氟喹诺酮类药物的最高残留限量；美国食品及药物管理局(FDA)则将氟喹诺酮类作为禁止使用的药物；我国农业部在235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》也对氟喹诺酮类抗菌药在动物性食品中的最高残留限量作了规定。

目前，喹诺酮类药物的检测方法主要包括：微生物分析法[4]、荧光光度法[5]、毛细管电泳法[6]、液相色谱-串联质谱法[7]、酶联免疫法[8]等。胶体金免疫层析法是20世纪90年代新兴的一种新型免疫学检测技术，其反应所需要原料的全部或大部分均已整合到试剂板中，不仅试剂携带方便，试验操作简单，肉眼即可直接判定结果，并且还有准确度高、特异性强的优点，目前已越来越广泛运用于食品安全中药物残留的检测。

1 材料和仪器

1.1 材料和试剂

1.2 仪器

BioJet XYZ 3 000型点膜仪，购自美国BioDot；UV-752紫外-可见光分光光度计，购自美国UNICO公司；Avanti J-26XP高速冷冻离心机，购自美国Becman公司；恒温鼓风干燥箱，购自上海精宏实业设备有限公司；切割机，购自杭州市恒通设备有限公司；胶体金读数仪，购自杭州南开日新生物技术有限公司；78HW-1恒温磁力搅拌器，购自杭州仪表电机有限公司。

2 试验方法

2.1 金标抗体溶液配制

取1 L胶体金溶液(颗粒直径40 nm左右)使用K2CO3及HCl调整至最适标记pH值后，加入适量环丙沙星多克隆抗体，过夜稳定后加入5% BSA至BSA最终质量分数为1%，离心纯化后沉淀用0.01 mol/L PB溶液(含1% BSA和 0.05% NaN3)重悬，4 ℃保存备用。

2.2 试剂板的组装和样本处理方法

组装：取稀释好后的CIP-EDC-OVA和羊抗兔IgG适量喷于NC膜上，分别形成相距0.5 cm的检测线(T线)和质控线(C线)，37 ℃烘箱干燥2 h；将金标抗体溶液按3 μL/cm喷至玻璃纤维上作为金标结合垫，置于37 ℃烘箱干燥2 h；分别将样品垫、金标结合垫、NC膜、吸水垫黏于PVC板上，使用切割机切成3 mm宽度的试剂板，装入塑料模板中压成试剂板(图1)。

样本处理：取2 g匀质样本于5 mL离心管中；加入3 mL提取剂，剧烈振荡3 min后，室温下4 000 r/min离心5 min；移取上层溶液1 mL于新5 mL离心管中，65 ℃ 下氮(空)气吹干；向吹干的离心管中加入0.3 mL正己烷和0.3 mL PBST溶液，上下颠倒混匀1 min，静置分层后吸取下层溶液0.1 mL，垂直滴加至试剂板样品槽中，3～5 min后读取结果。

结果判定：使用金标读数仪读取，T、C线值，分别代表T、C线上胶体金颗粒的多少。本试剂板采用对比法判定，若检测线(T线)显色浅于控制线(C线)显色，则判定为阳性；若检测线(T线)显色深于控制线(C线)显色，或者显色一样深，则判定为阴性；若控制线(C线)没有显色，检测线(T线)无论有无显色，均判定为无效板。

2.3 试剂板干燥时间的优化

NC膜上CIP-EDC-OVA及羊抗兔IgG包被完成后放入37 ℃烘箱干燥，每隔一段时间后取出组装成试剂板，使用PBST溶液滴定，观察并记录结果。

2.4 试剂板灵敏度

分别使用PBST溶液稀释环丙沙星标准品溶液至0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 μg/L，滴板检测并记录试验结果。

2.5 试剂板特异性

取环丙沙星及同类化合物标准品，PBST溶液稀释成梯度浓度后分别使用试剂板检测，记录灵敏度数值。

2.6 提取剂优化

取阴性鱼样、2 μg/kg环丙沙星添标鱼样，分别使用乙腈、酸性乙腈(2 mol/L HCl，2%V/V)、碱性乙腈(2 mol/L NaOH，2%V/V)、二氯甲烷、乙酸乙酯作为提取剂，按照步骤“2.5”节进行样本处理后检测，统计结果。

2.7 试剂板的检出限

取阴性鱼肉样本添加环丙沙星至最终质量分数分别为0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 μg/kg，使用乙腈提取后检测并记录试验结果，每个浓度设6个重复。

2.8 试剂板检测与液相色谱-串联质谱法的符合率

取不同批次的鱼样、虾样分别使用液相色谱-串联质谱法及本试剂板检测，比较试验结果。

3 结果与分析

3.1 试剂板干燥时间的优化

分别在0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0、24.0、48.0、72.0 h的时间点取出试剂板，使用PBST检测。由表1可知，试剂板在2 h时，T/C值已趋于稳定，当试剂板干燥时间为24 h时，T、C线显色趋于稳定。

表1 干燥时间对试剂板的影响

3.2 试剂板灵敏度

由图2可知，当环丙沙星浓度低于2 μg/L时，试剂板显色结果为阴性；当环丙沙星浓度≥2 μg/L时，试剂板显色结果为阳性。故试剂板的灵敏度可为环丙沙星2 μg/L。

3.3 特异性试验

各类化合物的灵敏度见表2。本试剂板对15种喹诺酮类药物均有反应，灵敏度在1～20 μg/L不等，具有良好的广谱性；同时与其他抗生素如四环素、磺胺二甲基嘧啶、氯霉素在2 mg/L的浓度下无反应，具有较好的特异性。

表2 试剂板特异性试验

3.4 提取剂优化

由表3可知，乙腈、酸性乙腈、碱性乙腈、二氯甲烷提取时阴性和阳性结果显色明显，梯度大小适中，均可作为提取剂使用，考虑到提取剂简化及二氯甲烷毒性较大，故采用乙腈作为提取剂。

3.5 检出限

由表4可知，环丙沙星的检出限为2.0 μg/kg。样本处理过程中，提取过程中标准品先从2 g样品中萃取至3 mL乙腈中，又由1 mL乙腈经过吹干复溶于0.3 mL PBST中，理论上提取过程环丙沙星浓度浓缩至原来的2倍以上，而检出限和灵敏度的结果一致，故提取效率及样品基质等对试剂板的检出限有一定的影响。

表3 提取剂优化试验

注：梯度即同等方法检测2 μg/kg环丙沙星添标样品与阴性样本时T/C值的差。

表4 样品检出限试验(n=6)

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。下表同。

3.6 与液相色谱-串联质谱法(LC-MS)的符合率

试剂板与液相色谱-串联质谱法的符合率详见表5。针对不同阴阳性样本，试剂板的检测结果与LC-MS结果一致，符合率100%。

表5 试剂板与液相色谱-串联质谱法(LC-MS)检测结果的符合情况(n=6)

4 讨论

喹诺酮类药物种类繁多，药效作用明显，因此现已成为最常见的滥用药物之一。2015年下半年农业部兽药残留监测计划共检测畜禽产品7 000份，不合格样品6批，全部为氟喹诺酮类药物超标[10]。我国国标检测方法主要使用液相色谱-串联质谱法，该方法虽然精确度高，但存在仪器设备昂贵、操作复杂、操作周期长等问题，不利于在基层养殖企业、监管单位推行。目前，我国食品安全日益得到重视，水产品、畜禽等农产品产地准出制度、市场监管制度日益完善。因此，简单、快速、准确的快检方法将更有利于在基层推广，具有较大的市场需求。

本研究建立了1种检测喹诺酮类药物的免疫胶体金试剂板，并应用于水产品的检测。该试剂板能同时检测15种喹诺酮类药物，灵敏度为1～20 μg/L，准确度高，适用于养殖企业、监管单位对样品的大规模筛查。