单宁、有机氮和pH值对森林土壤单宁-有机氮复合物沉降量的影响

邱 泓，马红亮，马 芬，毛盼盼，高 人，尹云锋

(湿润亚热带生态地理过程省部共建教育部重点实验室/福建师范大学地理科学学院，福建福州 350007)

植物单宁(vegetable tannin)，别称植物多酚(plant polyphenol)，是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物[1]。它在维管植物中的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素，主要存在于植物的皮、根、叶、果实中，含量可达20%[2-3]。单宁在生态系统中具有重要作用，红树植物的树皮和果皮中往往具有较高含量的单宁，它们可形成保护层，起到抑制微生物活动、杀灭病原菌的作用[4]。同时单宁还是一种化感物质[5]，研究表明，Kalmia属植物可通过产生单宁而影响腐殖质中营养的循环，进而引起云杉生长的非生物学阻碍[6]。近年来，单宁在生态系统土壤氮循环中发挥的作用越来越受到国内外学者的关注[7-9]。

氮循环是指自然界中的氮素以有机态、无机态和分子态的形式存在且互相转化的过程[10]。其中，土壤有机氮主要以蛋白质、氨基酸、多肽、氨基糖以及一些杂环状的氮化合物等形式存在[11-12]，且不同生态系统中的有机氮(包括氨基酸和蛋白质)含量不同[13-14]。作为一种碳源，单宁可通过其自身性质参与氮素循环，它在土壤中能与蛋白质、生物碱、多糖等发生反应，产生不溶性复合物[15]。单宁影响土壤氮保持、降低土壤氮矿化量的研究已有许多报道，通过研究单宁对土壤淋溶层碳氮动态的影响发现，单宁抑制总氨化速率的能力远高于纤维素，且可通过固定土壤中的氮，降低土壤的净氮矿化量[7]。单宁酸的加入可降低土壤硝态氮含量、铵态氮含量[16]。源于石南科和冷杉的纯化单宁主要通过捆绑或固定有机氮以及降低氮矿化量的形式来降低无机氮有效性[17]。缩合单宁可降低碳氮矿化量及酶活性，且可提高真菌和细菌的比值，因此，研究认为，叶片组织中的缩合单宁浓度是影响微生物群落和活性的一个因素[8]。此外，单宁还与土壤微生物含量有关，在红松林土壤中的单宁含量与土壤中的氨化细菌和硝化细菌含量呈正相关关系[18]。由于单宁-蛋白质复合物的产生与pH值条件有关[19]，因此，土壤理化性质可调节单宁对氮素的影响。由于来自不同植物的单宁含量、结构各异[7，20]，单宁对氮素转化的影响也会因有机氮的类型及单宁含量的不同而有所差异，因此，探讨不同单宁含量与土壤有机氮的关系已成为研究单宁对氮素转化与保持的重要环节之一，而目前的研究主要将单宁和有机氮反应形成单宁-有机氮复合物作为解释单宁影响氮素的原因，但关于单宁和有机氮反应形成单宁-蛋白质复合物的条件目前还不清楚，这制约了人们对其产物特性、动态变化和氮循环的认识。

本试验通过室内研究不同浓度的单宁酸与不同浓度的各种有机氮在2种pH值条件下的反应，探究单宁与有机氮的关系，对明确单宁在生态系统土壤氮素循环中发挥的作用具有重要的理论参考价值。

1 材料与方法

1.1 预试验

选用单宁酸(tannin acid，简称TA)作为单宁代表物。配制不同浓度单宁酸，使其与不同浓度的各种氨基酸反应，观察发现，单宁酸能与碱性氨基酸中的精氨酸(arginine，简称Arg)和赖氨酸(lysine，简称Lys)发生反应产生沉淀，因此选用精氨酸和赖氨酸进行下一步试验。用不同浓度单宁酸与不同浓度牛血清蛋白(bovine serum albumin，简称BSA)、酪蛋白(casein，简称Cas)反应，观察发现，单宁酸与2种蛋白质均能发生反应产生沉淀，因此选用2种蛋白质进行下一步试验。因此，选用单宁(单宁酸)和4种有机氮(精氨酸、赖氨酸、牛血清蛋白、酪蛋白)参与试验。

1.2 试验设计

设计3种浓度梯度，分别为HO组(高有机氮比例组)：含25 mg单宁酸和200 mg有机氮；M组(适中比例组)：含50 mg单宁酸和100 mg有机氮；HT组(高单宁比例组)：含100 mg单宁酸和50 mg有机氮。使用2种pH值梯度，分别为 0.2 mol/L pH值为4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液和0.2 mol/L pH值为7.0的磷酸盐缓冲液调节溶液。每处理设3个重复。

具体试验操作过程为在试管中加入10 mL缓冲液后，分别加入不同比例组的5 mL单宁酸和5 mL有机氮，HO组、M组、HT组单宁酸浓度分别为5、10、20 g/L，有机氮浓度分别为40、20、10 g/L，置于 200 r/min 摇床振荡30 min后，然后在 4 000 r/min 离心机上离心10 min，收集清液，待测。

1.3 样品分析

1.3.1 单宁含量测定 吸取1 mL样液，加入5 mL 10%三乙醇胺和100 μL 0.05 mol/L氯化铁，并用蒸馏水将溶液体积补充至20 mL，混匀，15 min后用紫外可见光谱仪(岛津UV-2450，下同)测定混合液在510 nm处的吸光度[19]。

1.3.2 蛋白质含量测定 吸取1 mL样液，加入5 mL考马斯亮蓝G250，混匀，10 min后用紫外可见光谱仪测定混合液在595 nm处的吸光度[21]。

1.3.3 精氨酸测定 吸取1 mL样液，加入8 mL 15 g/L氢氧化钠和1 mL显色剂(含50 g/L甲萘酚、0.2 mL/L双乙酰)，混匀，在30 ℃条件下水浴15 min，取出，在室温条件下放置30 min后，混匀，然后用紫外可见光谱仪测定混合液在 525 nm 处的吸光度[22-23]。

1.3.4 赖氨酸测定 吸取1 mL样品，加入2 mL茚三酮试剂和0.2 mL 0.2%维生素C溶液，混匀，盖上玻塞，置于沸水中水浴加热15 min后取出，并立即置于冰水中冷却15 min，然后用60%乙醇溶液将溶液体积补充至20 mL，混匀，用紫外可见光谱仪测定混合液在570 nm处的吸光度[24]。

1.4 数据统计分析

采用Origin 8.0和SPSS 17.0软件对数据进行统计分析及作图，图中数据均为平均值±标准偏差，不同处理与变量之间的显著性检验采用单因子方差分析(ANOVA)和最小显著差异法(LSD)。通过测定反应后清液中的单宁酸与各有机氮浓度来计算参与反应的单宁酸与有机氮的沉降量，探究单宁与有机氮的反应条件。

2 结果与分析

2.1 单宁酸与蛋白质的反应

由图1可知，在pH值为4.7的条件下，M组的单宁酸沉降比例最高，为91.96%，HT组最低，为52.76%；牛血清蛋白沉降比例在M组最高，为93.87%，在HO组最低，为76.50%。单宁酸的沉降量在HT组最大，为52.76 mg，在HO组最小，为20.53 mg；牛血清蛋白的沉降量在HO组最大，为153.00 mg，在HT组最小，为42.01 mg。

在pH值为7.0的条件下，HT组单宁酸的沉降比例(48.71%)显著低于其他2组；3组牛血清蛋白的沉降比例差异不显著，均值为25.14%。单宁酸的沉降量在HT组最大，为48.71 mg，在HO组最小，为 23.22 mg；牛血清蛋白的沉降量在HO组最大，为50.77 mg，在HT组最小，为11.62 mg。

由图2可知，在pH值为4.7的条件下，HO组单宁酸几乎不参与反应，其沉降比例仅为0.63%，HT组单宁酸(63.02%)显著高于M组单宁酸(60.53%)；HO组酪蛋白的沉降比例最高，为98.59%，HT组最低，为94.74%。单宁酸的沉降量在HT组最大，为63.02 mg，HO组最小，仅为 0.16 mg；相反，酪蛋白的沉降量在HO组最大，为197.19 mg；在HT组最小，为47.37 mg。

在pH值为7.0的条件下，参与反应的单宁酸和酪蛋白沉降比例的显著性差异规律相同，两者均在HT组最高(单宁酸为27.58%，酪蛋白为97.07%)，在M组最低(单宁酸为5.23%，酪蛋白为61.01%)。单宁酸的沉降量在HT组最大，为 27.58 mg，在M组最小，仅为2.62 mg；相反，酪蛋白的沉降量在HO组最大，为132.83 mg，在HT组最小，为48.54 mg。

2.2 单宁酸与氨基酸的反应

由图3可知，在pH值为4.7的条件下，单宁酸沉降比例在HO组最高，为81.97%，在HT组最低，为9.73%；各浓度梯度的赖氨酸沉降比例没有显著差异，均值为39.09%。单宁酸的沉降量在M组最高，为22.06 mg，在HT组最低，为 9.73 mg；赖氨酸的沉降量在HO组最大，为81.12 mg；在HT组最小，为18.34 mg。

在pH值为7.0的条件下，M组单宁酸沉降比例(38.27%)显著高于其他2组；HO组(39.72%)赖氨酸沉降比例显著低于其他2组。而单宁酸的沉降量在HT组最大，为29.91 mg，在HO组最小，为6.89 mg；赖氨酸的沉降量在HO组最大，为79.44 mg，在HT组最小，为22.63 mg。

由图4可知，在pH值为4.7的条件下，M组的单宁酸沉降比例显著高于其他2组，为45.41%；精氨酸沉降比例在M组最高，为57.00%，在HT组最低，为49.76%。单宁酸的沉降量在M组最大，为22.71 mg，在HO组最低，仅为3.42 mg；精氨酸的沉降量在HO组最大，为106.20 mg，在HT组最小，为 24.88 mg。

在pH值为7.0的条件下，单宁酸沉降比例没有显著差异，总体均值为44.21%；精氨酸沉降比例仅M组(59.78%)与HT组(58.02%)有显著差异。单宁酸的沉降量在HT组最大，为41.48 mg，在HO组最小，为11.66 mg；精氨酸的沉降量在HO组最大，为117.71 mg，在HT组最小，为29.01 mg。

3 讨论

本试验结果表明，pH值可影响单宁-有机氮复合物的沉降量。酪蛋白、牛血清蛋白的等电点pH值分别为4.6、4.7。有研究发现，单宁和牛血清蛋白产生最高沉淀量的pH值接近于牛血清蛋白的等电点(pH值=4.7)[25]，其原因为蛋白质处于等电点时，蛋白质分子之间的静电排斥最小[26]，此时蛋白质容易发生凝集产生沉淀，因此在pH值为4.7的条件下，2种蛋白质沉淀的比例和质量整体较高；但在pH值=7.0时，远离等电点，依然有蛋白质沉淀(虽然沉淀比例整体较等电点低)，说明单宁具有结合蛋白质的能力。HO组、M组、HT组单宁酸-牛血清蛋白复合物在pH值=4.7时的沉降量分别比 pH值=7.0时高134.53%、91.84%、57.09%；HO组、M组、HT组单宁-酪蛋白复合物在pH值=4.7时的沉降量分别比 pH=7.0时高44.38%、101.16%、45.02%；HO组、HT组的单宁酸-酪蛋白复合物的沉降量高于单宁酸-牛血清蛋白复合物的沉降量。Hagerman等研究发现，单宁在pH值大于9.0时会失去与蛋白质的结合能力，这与单宁酚基的酸离解常数(pKa)有关[27]。本试验结果发现，即使在较低单宁含量(25 mg)的条件下，只要有较高含量的蛋白质就会发生沉降，且与蛋白质的类型有关。研究表明，白坚木单宁、单宁酸与牛血清蛋白的反应比例分别为 1 ∶4、2 ∶3[28]，而不同植物提纯单宁与牛血清蛋白的反应比例在2 ∶5～3 ∶5之间[15]。本研究中单宁酸与牛血清蛋白的反应比例则为1 ∶7(HO组，pH值=4.7)～4 ∶1(HT组，pH值=7.0)；在相同pH值条件下，pH值=4.7时，该比例为1 ∶7(HO组)～6 ∶5(HT组)；pH值=7.0时，该比例为 1 ∶2(HO组)～4 ∶1(HT组)，说明单宁与有机氮反应的浓度比例会在很大程度上影响参与反应的单宁和有机氮的量与比例。

HO组、M组单宁酸-赖氨酸复合物在pH值=4.7 时的沉降量分别比pH值=7.0高17.70%、0.49%；HO组、M组、HT组单宁酸-精氨酸复合物在 pH值=4.7时的沉降量分别比pH=7.0低15.27%、2.85%、47.01%，相同条件下单宁酸-精氨酸复合物的沉降量高于单宁酸-赖氨酸复合物的沉降量。本试验中赖氨酸、精氨酸的等电点分别是9.7、10.7，由于2种氨基酸的等电点与pH值=7.0条件更为接近，因此pH值=7.0时的氨基酸沉降量整体较pH值=4.7 条件大。在单宁与氨基酸的反应中，氨基酸提供质子化的氨基(NH3+)(在pH值高于7.0的条件下，没有质子化作用)，单宁提供负电荷(在pH值小于4.0的条件下，单宁几乎不具有电荷数)[29]，使得二者结合。精氨酸本身能够形成多重氢键[30]，有研究发现，氢键在单宁-蛋白质复合物的形成中具有重要作用[31]，这可能是在单宁酸与氨基酸的反应中，单宁酸-精氨酸复合物沉降量多于单宁酸-赖氨酸复合物沉降量的原因。在单宁酸与有机氮的反应中，单宁酸-氨基酸复合物的沉降量低于单宁酸-蛋白质复合物的沉降量，且并不是所有的氨基酸都和单宁发生反应产生沉淀，前期试验结果表明，丙氨酸、谷氨酸、甲硫氨基酸、无机氮不能与单宁酸反应产生沉淀，这与单宁性质有关，本研究选用单宁酸作为单宁代表物，而在挪威云杉提纯缩合单宁与20种氨基酸反应的研究中发现，单宁仅与精氨酸发生反应，且反应pH值在4.0～7.0范围内[19]；从欧洲蕨(Pterdiumaquilinum)提取的单宁能与组氨酸反应产生沉淀[32]；也有研究发现，缩合单宁(原花青素)能与丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸发生反应[25]。本试验结果发现，单宁酸能与精氨酸、赖氨酸反应产生沉淀，进一步说明单宁结构的复杂性对有机氮沉降的影响不同。

一般来讲，长江以南的土壤多呈酸性或强酸性，长江以北的土壤多呈中性或碱性[33]。细分到不同土壤，酸性或强酸性土壤有铁铝土、淋溶土、半淋溶土等；中性或碱性土壤有钙层土、干旱土、漠土、初育土、半水成土、水成土、盐碱土、高山土等[34]。典型的农业土壤通常具有较高的pH值，有时甚至超过8.0[35]，我国亚热带的土壤主要呈酸性，pH值在4.0左右[36]；此外，各种土壤的单宁数量和结构不同[31]。因此，单宁与有机氮形成的复合物在土壤中的作用与土壤类型有关。目前研究表明，稳定的单宁和有机氮的复合物是土壤保留有机氮的重要机制[19，37]，单宁通过固定有机氮[7，17]降低土壤中的无机氮[16，38]，直接或间接影响土壤中微生物[37，39]的方式影响氮素转化。Northup等研究认为，单宁-蛋白复合物具有降低氮淋溶的作用，并可作为1个氮源被一些植物的菌根共生体重新利用[40]。虽然单宁-蛋白质复合物很难被酶降解[41]，但其释放氮素的现象已有报道[6，28]，而单宁-有机氮复合物与单宁-蛋白质复合物的降解性有何异同还未见报道。Adamczyk等研究发现，单宁不仅能与一些氨基酸和蛋白质反应，还能与一些肽类、多胺、氨基糖类发生反应[19]，因此，在土壤中单宁与有机氮的结合很可能是其影响氮转化的重要原因。此外，单宁能与金属离子发生络合反应产生复合物[42]。张瑞娜等研究发现，单宁酸能与Fe3+离子反应生成单宁酸铁，而单宁酸铁具有吸附无机氮的作用[43]，在土壤中也很有可能有相似反应。因此，单宁在土壤中对氮素转化的影响既要考虑凋落物性质、数量的差异，也要考虑土壤类型和理化性质的调节。

4 结论

单宁、有机氮和反应溶液的pH值可影响单宁-有机氮复合物的沉降量。较低的pH值有利于沉降蛋白质，较高的pH值有利于沉降氨基酸，且在相同条件下单宁酸沉降蛋白质的量大于氨基酸。因此，在亚热带酸性土壤的氮素转化过程中蛋白质动态变化受单宁的影响可能较氨基酸大。