小麦根际解磷细菌的筛选鉴定及其促生效果

常慧萍，夏铁骑，付瑞敏，杨 雪，邢文会，韩鸿鹏，张 红

(1.河南教育学院生命科学系，河南郑州 450046； 2.濮阳职业技术学院，河南濮阳 457000)

氮、磷、钾是植物生长发育过程中必需的3种矿质元素，被称作“肥料三要素”。提高土壤磷素和磷肥的利用效率、开发磷肥资源潜能是节约磷肥的重要措施，对我国农业可持续发展具有重要意义。土壤中含量丰富的磷元素95%以上与土壤中的Fe3+、Ca2+、Al3+等结合，以难溶性的磷酸钙盐形式存在而丧失其有效性，导致我国2/3的耕地缺磷[1-2]。为解决土壤缺磷问题，提高作物产量，每年须向土壤中施入大量可溶性化学磷肥，但长期过量使用带来了环境污染、土壤板结、地力衰退、生态恶化和农产品品质下降等问题[3]。生产实践证明，微生物肥料在提升耕地土壤肥力、维持耕地土壤结构、保持耕地土壤健康、降低耕地土壤污染、提高耕地农产品品质上效果显著，在国家耕地质量提升的需求中具有广阔的应用前景[4]。

解磷微生物是能将土壤中难溶性化合态磷转化为植物能够吸收利用的可溶性磷的特殊微生物功能类群，在转化土壤难溶性磷、提高土壤中有效磷含量、磷肥利用率及促进作物生长等方面具有显著作用[5-6]。某些植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)可分泌有机酸溶解难溶性无机磷酸盐，或分泌胞外磷酸酶将难溶性的磷酸脂等有机磷消解，释放出生物有效磷，提高土壤中可溶性磷的含量，促进植物生长[1]。史发超等筛选了1株可溶解难溶性磷的菌株P83斜卧青霉菌(Penicilliumdecumbens)，能显著增加土壤有效磷水平，对玉米生长和增产具有显著作用[6]；姜瑛等分离了1株贪噬菌属(Variovoraxsp.)的固氮解磷菌JX14，显著促进了花生的生长及其全氮、全磷、全钾含量的提高[8]；张云霞等分离了1株高效解磷的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JT-1，提高了磷肥利用率10.79%，促进小麦增产12.3%[9]。根际微生物研究的最终目标是充分利用根际微生物资源，促进植物生长、保持植物健康、减少农用化学品的投入，从而促进农业可持续发展[10]。本研究根据PGPR的促生长指标如产生植物生长素、产生HCN、产生铁载体、溶磷、拮抗病原菌筛选小麦根际优良的解磷菌，通过小麦的Hoagland半固体培养基栽培试验，评估解磷菌剂对小麦生长的影响，以期为小麦高效解磷微生物肥料研究与开发提供优良的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

供试小麦种子为新麦26，土壤样品采自郑东新区小麦田，深度为0～20 cm根系及土壤，保存于无菌纸袋中。

1.2 培养基、试剂

所用培养基、试剂包括LB培养基与PDA培养基[11]、蒙金娜有机磷培养基与PKO无机磷培养基[12]、MM培养基[13]、NB培养基(牛肉浸膏3 g、酵母粉1 g、蛋白胨5 g、蔗糖10 g、琼脂18 g、蒸馏水1 L，pH值7.2)、CAS检测培养基[14-15]、Hoagland半固体培养基和磷酸盐(PBS)缓冲液[16]、蛋白胨水(蛋白胨10 g、氯化钠 5 g、蒸馏水1 L，pH值7.8)。

1.3 方法

1.3.1 土壤样品稀释液的制备 将小麦根系剪为约3 cm的根段并混合，称取10 g置于含有无菌水的三角瓶中充分振荡，得到小麦根际土壤悬液，将悬液稀释为10-1～10-6梯度稀释液。

1.3.2 小麦根际解磷菌的初筛 分别取10-3～10-6稀释液均匀涂布到PKO无机磷培养基和蒙金娜有机磷培养基上，初筛具有解磷能力的菌株。28 ℃培养3～5 d，挑取溶磷圈直径/菌落直径(D/d)较大的单菌落，多次继代培养，选取长势旺盛的菌株。

1.3.3 小麦根际解磷菌的复筛

1.3.3.1 产生长素(IAA)的测定[17]称取分析纯吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)，用蒸馏水配制浓度分别为10、20、30、40、50、60、80、100 mg/L的IAA溶液，在530 nm下测定各溶液的D530 nm，绘制IAA的标准曲线。

将初筛解磷菌接种于MM液体培养基中，25 ℃、180 r/min 振荡培养12 d，离心得上清液。取1 mL上清液加入2 mL Salkowski’s反应液(1 L 10.8 mol/L H2SO4中含4.5 g的FeCl3)，暗处25 ℃混合反应30 min。测定混合反应液D530 nm，空白培养基作为对照。根据IAA的标准曲线计算初筛菌株IAA产生量(mg/L)。

1.3.3.2 产铁载体检测[14，16]将初筛解磷菌于LB培养基上培养至对数期，按三点接种法点接在CAS固体检测平板上，28 ℃培养2 d。根据菌落周围是否出现明显的橙色晕圈，判断菌株产铁载体的能力。

1.3.3.3 产HCN能力测定 灭菌后NB培养基中添加甘氨酸(浓度为4.4 g/L)，划线接种初筛菌株，并把浸过2%碳酸钠、0.5% 2，4，6-三硝基苯酚溶液的滤纸平铺于平板上，28 ℃ 培养4 d，根据滤纸颜色变化(橘黄色转变为红色)判断菌株产HCN的能力。

1.3.3.4 解磷性能的测定[15，18]将初筛解磷菌接种到液体PKO培养基(或蒙金娜培养基)上，28 ℃、160 r/min振荡培养 4～5 d，4 ℃、10 000 r/min离心20 min，钼锑抗比色法测定有效磷含量。

1.3.3.5 产NH3能力测定 将初筛解磷菌接种到含蛋白胨水的试管中，28 ℃培养2～3 d，加入0.5 mL Nessler’s试剂，根据蛋白胨水颜色变化(由褐色变为黄色)判断菌株产生NH3的能力。

1.3.3.6 与病原真菌拮抗作用的测定[19]初筛菌株与病原菌拮抗作用的测定采用平板对峙法。PDA平板接种小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、水稻纹枯病菌(R.solani)，25 ℃培养5～7 d获得病原菌菌饼，LB液体培养基中培养初筛解磷菌48 h获得菌悬液。将病原菌与初筛菌株同时接种PDA平板：平板中心接种病原菌菌饼(直径为5～6 mm)，距中心约3 cm处滴加初筛菌株悬液。25 ℃培养3～5 d，记录病原菌的菌落半径(R)、病原菌点样中心点到被初筛菌株抑制的边缘的半径(r)，计算抑制率：抑制率=(R-r)/R×100%。

1.3.4 解磷菌株的鉴定 依据《常见细菌系统鉴定手册》对解磷菌HP1218的形态特征及生理生化特性进行研究。提取HP1218的总DNA，分析其16S rDNA基因序列。PCR扩增上游引物8f序列为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3′，下游引物1541r序列为5′-AAGGAGGTGATCCANCC RCA-3′，PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃ 终止反应。纯化获得的PCR产物由微基生物科技(上海)有限公司进行测序。将16 S rDNA基因序列通过BLAST程序与GenBank中核酸数据进行比对分析，使用MEGA 6.0软件对菌株进行系统发育分析，采用邻接法(Neighbour-Joining，简称NJ法)构建系统进化树。

1.3.5 解磷菌株对小麦幼苗生长的影响[20]选取饱满、健壮的小麦种子进行表面消毒，并于25 ℃暗处萌发2 d。设置2个处理：接菌处理(HP1218)，将解磷菌HP1218的培养液用PBS缓冲液洗涤并稀释至1×108CFU/mL左右，萌发种子浸入稀释菌液中吸附1 h；对照处理(CK)，萌发种子浸泡在PBS缓冲液中1 h。将2种不同处理的小麦种子分别播种于Hoagland半固体培养基中，人工智能培养箱中(25 ℃，14 h光照/10 h黑暗，40%～50%相对湿度)培养10 d，培养后10 d统计种子萌发的根数，并测定幼苗的根长与株高。

2 结果与分析

2.1 解磷菌株的初筛

在PKO无机磷培养基、蒙金娜有机磷培养基上分别涂布小麦根际土壤稀释液，28 ℃培养3～5 d后，挑取有溶磷圈的解无机磷细菌12株，解有机磷细菌12株，经多次继代，最终选取长势较好、D/d较大的解无机磷细菌4株，解有机磷细菌4株。

2.2 解磷菌株的复筛

对初筛的4株解无机磷细菌、4株解有机磷细菌进行生长性能的测定，结果见表1。根据菌株产IAA能力、溶磷能力，且具有产HCN、NH3或者产铁载体的能力，筛选出HP1218、HP1220、HP1223、HP1224菌株，与病原菌的进行拮抗试验。

表1 菌株的促生长性能

将HP1218、HP1220、HP1223、HP1224菌株分别与小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、水稻纹枯病菌进行拮抗试验，结果见表2。从表2可知，对3种病原菌均有抑制能力的菌株为HP1218、HP1223。综合两者的促生长特性，筛选HP1218作为解磷菌肥料的功能菌株。

表2 菌株对病原真菌的抑菌率

2.3 解磷菌株的鉴定

由表3可知，菌株HP1218呈短杆状、革兰氏阴性菌，不产芽孢，具有运动性；菌落淡黄色、圆形、湿润光滑、边缘整齐；能发酵葡萄糖，水解淀粉，不液化明胶，吲哚试验、甲基红试验、V-P反应阴性，能够利用柠檬酸盐和甘露醇，接触酶、过氧化氢酶阳性。

表3 解磷菌HP1218的形态特征及生理生化特性

对菌株HP1218的16S rDNA基因序列进行比对分析，构建系统进化树，由图1可知，HP1218与假单胞菌属成员具有较高的序列相似性，与假单胞菌属(Pseudomonassp.)菌株H9zhy(AM410625.1)亲缘关系最近，且BLAST比对结果显示2株菌的16S rDNA基因序列相似度达到99%以上。结合HP1218形态特征、生理生化特性，依据《常见细菌系统鉴定手册》，确定HP1218属于假单胞菌属(Pseudomonassp.)细菌。

2.4 解磷菌对小麦幼苗的促生效果

用PBS缓冲液稀释HP1218的菌液，小麦种子通过浸种方式接种。从图2可以看出，HP1218浸种处理萌发5条根的小麦种子所占比例为35.5%，显著高于对照(31.6%)；萌发6条根的小麦种子所占比例为13.5%，显著高于对照(9.4%)；萌发3条根和4条根的比例总和由对照59.0%下降为51.0%。由图3可知，HP1218浸种处理的小麦幼苗平均根长为12.4 cm，较对照增加20.4%；小麦幼苗平均株高为 15.4 cm，较对照增加13.2%。表明菌株HP1218对小麦种子的生根和幼苗生长均有明显的促进作用。

3 讨论与结论

我国74%的耕地缺磷，且土壤中95%以上的磷素呈无效态，作物对施入的磷肥当季利用率仅为5%～25%。由于大部分磷素与土壤中的Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等结合形成难溶性磷酸盐，导致土壤磷素快速积累，有效磷缺乏。具有解磷能力的植物根际促生细菌，能够矿化难溶性磷酸盐，为植物可吸收利用的可溶性磷，这些PGPR菌株可作为生产微生物肥料的潜在菌株。目前报道的解磷细菌主要有芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌菌属、固氮菌属(Azotobacter)等；解磷真菌主要是青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)和根霉属(Rhizopus)；解磷放线菌多为链霉菌属(Streptomyces)。史国英等从甘蔗根际土壤中筛选到1株具有较强解无机磷能力的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)BS06，研究表明BS06能显著促进甘蔗组培苗的生长并提高甘蔗植株的含磷量[21]。Babana等研究了大田条件下解磷微生物对小麦的促生效果，出苗5 d后小麦的根干质量增加128%[22]。陈丹阳等筛选到1株鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonassp.)的解磷菌，利用薄层层析法分析其产生的有机酸，并研究其解磷机理[23]。Hariprasad等对16株解磷菌在温室条件下进行了番茄接种试验，发现处理植株的根长、株高、鲜质量、干质量和番茄的磷含量均有不同程度的提高[24]；邢芳芳等筛选了1株具有溶磷作用的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)PSM，盆栽试验表明，PSM解磷菌显著提高白菜的叶绿素、生物产量和叶片数，对白菜的促生作用明显[25]。本研究根据菌株产IAA、NH3、HCN、铁载体的能力、溶磷能力以及拮抗病原菌的作用，从小麦根际筛选出解磷菌HP1218，具有产NH3和铁载体的能力，发酵液中IAA含量可达到 54.21 mg/mL，有效磷含量为35.39 mg/L，且对小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、水稻纹枯病菌3种病原菌均有拮抗能力。经鉴定，解磷菌HP1218属于假单胞菌属细菌。菌株HP1218浸种接种的小麦幼苗萌发5、6条根的比例分别比空白对照增加31.6%、9.4%；平均根长较空白对照增加20.4%，平均株高较空白对照增加13.2%。结果表明，解磷菌HP1218对小麦种子的生根和幼苗生长均有明显的促进作用，可作为解磷微生物肥料开发的功能菌株。