水热法合成氮、钴双掺杂的荧光碳点及其性能研究

(1. 福建医科大学药学院药物分析系， 福州 350004；2. 福建省产品质量检验研究院国家加工食品质量监督检验中心， 福州 350002)

传统的量子点(Quantum dots，QDs)，由于其极小的粒径而产生尺寸效应和量子限域效应，被激发以后能发射荧光，因此被广泛应用于分析检测、光学成像方面。但是传统的半导体量子点如CdSe/ZnS型量子点，由于含有重金属元素而具有一定的毒性，可能会对细胞与环境产生危害，从而限制了它的应用。碳点(carbon dots，CDs)是以碳元素为前体，比以往的量子点更安全，对生物分子的干扰小，有望代替传统的量子点而被应用到光学成像[1]、生物医学[2]及分析检测[3]领域。

2004年Xu[4]等在制备单壁碳纳米管过程中，首次发现了一种具有荧光性能的碳纳米颗粒。2006年Sun[5]等首次采用激光刻蚀法制备粒径为5 nm左右的碳点，该法可通过调节激光器脉冲能量和时间来调控碳点的大小，但需要昂贵的实验仪器且量子产率较低，不利于大规模生产[6]。2008年Zhao等[7]在水溶液中用电化学氧化石墨棒的方法制备荧光碳点。2009年Zhu等[8]用微波法合成荧光碳点，该方法简便、经济。2010年Zhang等[9]以L-抗坏血酸为碳源利用水和乙醇的混合液为溶剂，在密闭的反应釜中加热一定时间来制备碳点，由于设备简单且条件可控，从而实现碳点荧光发射的调控。

近年来，科学家们希望找到制备较为简便，造价更为低廉的方法来制备性能优异的碳点，并将其成功应用于医学、光电学、生命科学[10-12]等领域。最近研究表明[13]碳点的粒径与表面特征对其性质有至关重要的影响。小粒径的碳点比表面积大，表面发光位点也较多。因此小粒径的碳点发光强于大粒径的碳点，进一步表明碳点发光是与表面相关的。另外，表面含有大量含氧基团如(羟基、羧基等)的碳点具有良好的水溶性且易于实现进一步功能化，良好的水溶性是纳米材料表现出低毒性[14]的首要条件。本实验以能同时提供C、N、Co元素的VB12为合成前驱体，采用一步水热法制备水溶性荧光碳点，通过紫外-可见吸收光谱(UV-vis)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、X射线光电子能谱(XPS)表征可知所制备的碳点表面含有大量羧基。最后，实验采用肝癌细胞(Hep G2)通过Cell counting kit 8(简称CCK-8)实验法测定碳点的细胞毒性。

2 实验部分

2.1 试剂与仪器

维生素B12：sigma公司；2-氨基吡啶：上海国药集团化学试剂有限公司；RPMI-1640培养液：海克龙Hyclone公司；PB缓冲液：0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4，用NaOH溶液和H3PO4调至不同的pH缓冲液；PBS缓冲液：分别称取KH2PO40.27 g，Na2HPO41.42 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，加蒸馏水约800 mL ，用浓盐酸调pH至7.4后定容到1 L。3-(4，5-二甲基噻唑-2) 2, 5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液：0.0075 g MTT，用1.5 mL DMSO溶解；透析袋，上海绿鸟有限公司。上述试剂如无特别说明，均为分析纯。

YZ-HR-25ML反应釜，北京岩征生物科技有限公司；UV-2450型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；F-4600型荧光分光光度计，日本日立公司；Nicolet 380 红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技；Tecnai G2 F20场发射透射电子显微镜，美国 FEI 公司；LabRAM HR800激光共聚焦拉曼光谱仪，法国Horiba Jobin Yvon公司；Thermo ESCALAB 250XI 电子能谱仪，美国赛默飞世尔科技；BS110S电子分析天平，美国Sartorius 公司；Neofuge 23R台式高速冷冻离心机，上海力新仪器有限公司；pHS-3E型精密酸度计，上海雷磁仪器厂；Multiskan Mk3全自动酶标仪，美国赛默飞世尔科技。

2.2 荧光碳点的制备

首先精密称取0.1355 g VB12，缓慢加入50 mL去离子水，配制成2 mmol/L的红色透明溶液，存放在50 mL玻璃瓶中，4 ℃冷冻避光保存。移取10 mL上述溶液于25 mL聚四氟乙烯反应釜内衬中，于烘箱中反应并控制一定的水热温度与时间进行合成碳点。反应结束后，待溶液自然冷却至室温，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调pH至11.0后于25 ℃ 12000 r条件下离心10 min除去大颗粒物质，经0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液在转速10000 r/min下的超滤管(截留分子量为3 kd)超滤30 min。取超滤管下层分子量< 3kd的液体得到颗粒较为澄清溶液即为氮、钴双掺杂的碳点固体。

2.3 荧光量子产率的测定

荧光量子产率(fluorescent quantum yield)的测定是以2-氨基吡啶为参比物质，通过测量碳点和2-氨基吡啶的稀溶液在碳点最佳激发波长下所得的积分荧光强度和该激发波长下的吸光度值(吸光度值应小于0.1)。其计算公式为：

ΦX=ΦST*(GradX/GradST)*(ηX2/ηST2)

其中，ФX为待测物质的荧光量子产率，ФST为已知参比物质的荧光量子产率；GradX和GradST分别表示待测物质和参比物质的积分荧光强度与吸光度作图工作曲线的斜率；ηX和ηST分别表示待测物质和参比物质的折光系数，0.1 mol/L 2-氨基吡啶的荧光量子率为60%，0.1 mol/L 硫酸水溶液和碳点水溶液的折光系数相同，均为 1.33。

2.4 碳点的细胞毒性研究

碳点具有较好的生物相容性和低细胞毒性，细胞毒性用Hep G2细胞通过CCK-8分析测定。CCK-8试剂中含有WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)，它可被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物。用全自动酶标仪在490 nm波长处测定其吸光度，可间接反映活细胞数量，从而作为碳点细胞毒性判断依据。

3 结果与讨论

3.1 水热温度的影响

水热法是在密封的压力容器中，提供一个在常压下无法达到的特殊物理化学环境，使前驱体在反应系统中生成核结晶[15]。提高反应温度或延长反应时间均可以促进VB12的碳化[16]。

首先对水热反应温度进行考擦，实验中发现较低温度(160和180℃)下合成的碳点溶液放置在 305 nm紫外灯下观察，所发出的荧光十分微弱。当温度升高至200～250℃后，荧光强度明显增大。可见水热温度对碳点的合成起着至关重要的作用，且高温有利于碳点的快速生成。图1为VB12溶液在200～250℃条件下水热4 h制备得到碳点溶液的荧光光谱图。其中插图为碳点溶液在紫外灯照射下的图片。由图看出，碳点发蓝色荧光，当温度由180℃升到 250℃时，其荧光强度不断增强，发射波长无明显变化。这可能是因为在较高的反应温度下制备的碳点其表面的氧化程度越高，带了更多的缺陷发光位点。通过计算不同温度(180～250℃)、4 h条件下合成碳点的荧光量子产率，在高温250℃下荧光量子产率达8.16%(见表1)。

图1 不同合成温度下碳点的荧光光谱

3.2 水热时间的影响

实验还对水热时间对碳点荧光的影响进行了考察，选择了一系列水热反应时间(见表1)。表1为不同条件下制备的碳点荧光量子产率。随着反应时间的增加，荧光强度呈现明显上升的趋势。由表1可知，随着反应温度的升高和反应时间的延长，荧光量子产率逐渐增大。值得注意的是，当温度升高至250℃后，反应1 h的荧光量子产率大于200℃与220℃下反应4 h的荧光量子产率。此外在240℃、6 h 条件下所合成的碳点，其荧光量子产率为7.56%，仍然小于250℃、4 h条件下合成的碳点。可见升高温度碳点的荧光量子产率的提高明显比延长反应时间来得有效，可以在较短时间内得到荧光效率更高的碳点，缩短反应周期，提高反应效率。

表1 不同条件合成碳点的荧光量子产率

3.3 碳点的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱

图2A为250℃下反应4 h合成碳点的紫外吸收光谱，从图中可以看到碳点溶液在275 nm处有吸收峰，这是由于碳点结构中C=C发生了π→π*跃迁所产生的。图2B为碳点荧光光谱，随着激发波长的不断增大，碳点的荧光强度先增大后减小，发射波长随激发波长的改变并未发生明显变化，最大激发波长为275 nm。图2C为碳点最佳激发波长和最佳发射波长对比图，由图可知碳点溶液的最佳激发波长和最佳发射波长为275 nm和380 nm，激发波长与发射波长之间存在很大的斯托克位移(105 nm)，可有效避免激发峰与发射峰的重叠，减小干扰，有利于碳点作为荧光纳米探针用于分析检测。

3.4 碳点的形貌表征

碳点水溶液呈墨绿色透明状，且长期静置后无明显沉淀，可知所制备的碳点具有良好的水溶性。图3A为碳点的高分辨透射电镜图，由图可知，碳点呈规则的单分散球形，平均粒径为3.26 nm，可均匀分散在水溶液中。晶格间距为0.26 nm，查文献[15]可知与石墨的(100)晶面层间距一致(图3B)。

图2 碳点的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱A.碳点溶液的紫外-可见吸收光谱；B.碳点溶液的荧光光谱；C.碳点溶液的最佳激发发射波长

图3 碳点的高分辨透射电镜(A)和粒径分布图(B)

3.5 碳点的红外表征

图4为碳点的红外表征图，由图可知，碳点在1726 cm-1处有吸收，说明有C=O的存在；在3153 cm-1处的吸收峰对应-OH的伸缩振动峰，该峰强而钝表明碳点表面的羟基间有氢键生成；1398 cm-1为C=N的伸缩振动峰；1629 cm-1为N-H的吸收峰；需要说明的是，结合1726 cm-1处的C=O峰及3153 cm-1处较宽的-OH吸收峰，说明碳点表面存在-COOH；综上所述，可知碳点表面含有-OH、C=O、-COOH和C=N等官能团。C=N来自前驱体维生素B12中与金属离子Co2+螯合的C=N键，我们可推测C=N→Co2+螯合键部分未遭到破坏，由此初步猜测在水热反应过程后，所制备的CDs中的Co2+仍以螯合物形式存在。

图4 碳点的红外光谱图

3.6 碳点的X-射线光电子能谱

实验采用X射线光电子能谱(XPS)对C-dots所含元素进行分析。图5为碳点的X-射线光电子能谱，对图5A中的O1S峰C1S峰N1S峰分别进行分峰拟合得到O1S(图5B)、C1S(图5C)、N1S(图5D)和Co(图5E)的高分辨图谱。由于Na元素所致的强背景峰，使微弱的Co元素峰在总XPS图中几乎不可见。图5A中的284.8 eV、397.9 eV、531.1 eV、778.6 eV分别代表C 1s、N 1s、O 1s、Co4d的结合能，由图谱可知碳点表面含有大量的C、O和N元素，Co含量极少，这也许同前驱体VB12的元素组成(C63H88CoN14O14P)有关。

3.7 pH对碳点荧光强度的影响

实验考察pH(2.0～12.0)对碳点溶液荧光强度的影响。结果表明合成碳点在pH 2.0～5.0条件下荧光强度较高，碳点溶液的pH为1～2，碳点表面含有羧基短链，在酸性条件下碳点基本处于单分散状态，荧光强度最大且稳定。然后在pH 6.0之后，碳点荧光强度随着pH的增大而不断减小，这可能是由于碳点表面的羧基解离程度改变，影响了碳点的荧光强度。

3.8 CCK-8细胞毒性检测

首先用RPM1-1640培养液将氮气下保存的肝癌细胞(Hep G2)复苏增殖并传代，得到一定数量的细胞。用胰酶将其从培养基上消化下来，用RPM1-1640培养液配成一定浓度的细胞悬液。将肝癌细胞转移至96孔板，于37℃、5%CO2条件下培养24 h后，弃去上清液并用PBS缓冲液清洗细胞，再在不同孔内分别加入200 μL的12.5、25、50、100和

图5 碳点的X-射线光电子能谱A.碳点的 XPS谱图;B.O1S XPS谱;C.C1S XPS谱;D.N1S XPS谱;E.Co4d XPS谱

200 μg/mL 的培养液配制的碳点溶液，每个浓度设置5个平行孔。对照组加入200 μL的培养液，并设置6个空白孔，继续培养24 h。取出上述制备的培养板，弃除上清液并用PBS清洗后，往各孔中加入20 μL PBS缓冲液配制的MTT溶液和180 μL无血清的培养基，再次在37℃、5%CO2下培养4 h。最后用酶联免疫检测仪测定各孔在490 nm波长处的吸光度，记录并计算细胞存活率(ηviab)。计算公式：

ηviab=(Dsample-Dblank)/(Dcontrol-Dblank)×100%

式中：D为吸光度，下标为sample的表示孔中加有碳点溶液。下标为control的表示孔中未加碳点溶液，下标为blank的表示孔中没有加肝癌细胞。

如图6所示，随着碳点溶液浓度的增大，细胞存活率并未呈下降趋势，甚至浓度达到200 μg/mL时，也没有产生明显的细胞生长抑制作用。从结果观察到肝癌细胞在含有浓度为12.5 ～ 200 μg/mL碳点的培养基中的活度与空白对照组相当，说明该碳点对肝癌细胞不但没有毒性，还有微小的生长刺激性，可能是由于该碳点良好的水溶性与碳材料的化学惰性，使其具有极低的细胞毒性，且合成碳点中的Co2+以螯合物的形式存在，并不会对细胞产生生物毒性。

图6 不同浓度CDs的细胞存活率

4 结论

本研究以VB12为合成前驱体，采用一步水热法制备氮、钴双掺杂的荧光碳点，优化水热反应时间和温度对碳点荧光性能的影响，实验发现250℃下反应4 h合成的碳点荧光量子产率最高，可达8.16%，在紫外灯下碳点溶液呈现明亮的蓝色荧光。合成碳点颗粒平均粒径为3.26 nm，表面含有大量羧基，具有良好的水溶性和稳定性。实验考察pH对碳点荧光强度的影响，结果表明该碳点在pH2.0-5.0范围内荧光最强。最后实验还进行了碳点的CCK-8细胞毒性检测，结果表明该碳点具有极低的细胞毒性和良好生物相容性。以上所有结果表明，通过本实验合成的氮、钴掺杂碳点有望作为荧光纳米探针应用于生物医学等领域。