响应面法优化超声波辅助木瓜蛋白酶嫩化牛肉

王清波 张慜 杨朝晖

摘要：采用超声波辅助木瓜蛋白酶的方式对生牛肉进行嫩化，探究酶用量、处理温度、超声波功率和超声波时间对牛肉剪切力和感官评分的影响，最终以酶用量、处理温度和超声波功率为嫩化因素，以剪切力为响应值，运用响应曲面法对嫩化牛肉的工艺参数进行优化。结果表明，超声波辅助木瓜蛋白酶嫩化牛肉的最优工艺参数为：酶用量16 U/g，处理温度51℃，超声波功率151 W，超声波时间20 min，此条件下嫩化得到的牛肉剪切力值为3 887.21 g，与对照组（7 629.16 g）相比降低49.0%，试验值与预测值较为吻合。采用超声波辅助木瓜蛋白酶嫩化牛肉，一定程度上可以减少酶的用量，缩短嫩化时间，同时又能保證良好的嫩化效果。

关键词：牛肉；超声波；木瓜蛋白酶；嫩化；响应面优化

中图分类号：S879.2：TS251.5+2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）05-0136-07

Abstract In this paper， we tenderized the beef using papain combined with ultrasonic to study the effect of enzyme dosage， treatment temperature， ultrasonic power and time on the shear force and sensory evaluation of the beef. Finally， with enzyme dosage， treatment temperature and ultrasonic power as the factors and shear force as the response variable， the tenderization conditions were optimized by response surface methodology. The results showed that the optimal conditions for tenderization of beef by papain combined with ultrasonic were obtained as follows： enzyme dosage at 16 U/g， treatment temperature at 51℃， ultrasonic power at 151 W， and ultrasonic time as 20 minutes. The actual shear force of beef under the optimal conditions was 3 887.21 g， which reduced significantly compared with the control （7 629.16 g） by 49%. The actual value was basically consistent with the predicted values of the model. Papain combined with ultrasonic could not only guarantee nice tenderization effect on beef， but also partly reduce the enzyme dosage and the treatment time.

Keywords Beef； Ultrasonic； Papain； Tenderization； Response surface optimization

嫩度是评价肉类品质的最重要因素之一，它极大地影响了消费者的可接受性[1]。肉质嫩化的主要机理是肌肉组织中的肌动球蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白发生水解，结缔组织遭到破坏，被分解成无定形的小块[2]。近年来，食品科学研究者一直在探寻能有效改善肉类品质的嫩化方法[3]。目前国内外应用于肉制品加工工业的嫩化方法主要分为物理法（高压处理、超声波法、滚揉法等）、化学法（钙盐处理、磷酸盐注射、添加淀粉[4]等）和生物嫩化法（外源酶嫩化处理，包括木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶等）[1]。

作为一种有效的嫩化方法，酶嫩化已经在肉品加工工业中应用了多年。外源酶如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、猪胰酶等已被广泛地用作肉嫩化剂[5]。由木瓜乳胶中提取而来的木瓜蛋白酶是工业肉嫩化中最常见的一种植物酶，因为它可以破坏肉的肌纤维蛋白和结缔组织[6]。研究表明，木瓜蛋白酶不仅能有效提高肉的嫩度，还可以在不产生不良风味的同时甚至能更好地改善其风味。夏军军等[7]以剪切力为响应指标，采用响应面法优化了木瓜蛋白酶嫩化牛腿肉的工艺。朱建等[8]采用正交试验优化得到了木瓜蛋白酶处理羊肉的最优嫩化条件。 Gerelt[5]、Ionescu[1]和Whitehurst[9]等均探讨了牛肉经过木瓜蛋白酶处理后的肌纤维断裂和嫩度改善情况。然而，酶嫩化面临着一个普遍问题，即如何使酶在物料内部的分布更均衡，作用效率更高。另外，酶活性的变化是影响结果的重要因素，若用量稍多可能就会使得水解过度，造成肉质老化、持水性下降、口感及风味变差等问题[10]。

超声波是指频率高于20 kHz的机械波[11]。超声波可以诱导和压迫细胞结构从而产生微小气泡，这种现象称为空化效应，其高能量的传播会在组织内部引起强烈反应，造成肉内部结构的损坏，从而达到一定的嫩化效果[3， 12]。超声波用于肉质嫩化时可引起物理性的组织蛋白酶和钙离子的释放，从而破坏肌肉组织[13]。Dickens等[14]研究了低频率超声波（40 kHz，15 min）对肉鸡胸肌的影响，发现可改善熟制后鸡胸肉的嫩度和质构属性。杨性民等[15]通过正交试验发现超声波联合木瓜蛋白酶对虾干的嫩化效果优于CaCl2和复合磷酸盐联合超声波。短时低强度的超声波处理还能够提高某些酶自身的活性。黄六容等[16]研究发现在一定的超声波功率下，木瓜蛋白酶活性随时间延长呈现先增高后下降的趋势。另外，超声波还被作为主要或辅助手段用于猪肉片[17]、牛肉[18]、鱿鱼[19]、羊肉[20]等的嫩化。

综上，无论是单一木瓜蛋白酶处理，还是单独超声波处理，均可对肉类达到一定的嫩化效果。同时，超声波对木瓜蛋白酶的性质有一定的积极影响，而目前超声波辅助木瓜蛋白酶对肉类嫩化效果方面的研究较少。因此，本研究采用响应面优化法，用超声波辅助木瓜蛋白酶对牛肉进行嫩化，以评价肉类嫩化效果广泛采用的剪切力作为评价指标，考察处理温度、木瓜蛋白酶用量、超声波时间、超声波功率对牛肉嫩化效果的影响，优化其工艺参数，以期为肉制品的嫩化提供更多的研究思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

冷冻生牛肉（-18℃以下配送，产地阿根廷，品种安格斯牛，取自腹部，瘦肉部分与非瘦肉部分平均质量比例为4∶1）；木瓜蛋白酶（10万 U/g），广州华琪生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

TA-XT2i型物性测试仪，英国 Stable Microsystems公司；DZQ型真空包装机，上海市尤溪机械设备有限公司；HH-S 型水浴锅，郑州市长城科技工贸有限公司；10001型电子天平，常州宏衡电子仪器厂；带有恒温设备的超声波设备（频率20 kHz），宁波市新芝生物科技股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 牛肉嫩化处理方法 用pH 7.0的磷酸盐缓冲液配制不同浓度的木瓜蛋白酶溶液，4℃冷藏保存，待用。

将牛肉从冷冻室取出，在0～4℃条件下解冻24 h至中心温度达到0℃以上，顺牛肉的肌纤维方向切成3 cm×6 cm×6 cm的肉块[21]，用滤纸吸干表面水分，采用10 mL注射器吸取10 mL酶液，对瘦肉部分进行均匀注射，尽量保证酶液在肉块中分布均匀，然后将肉块转移至13 cm×19 cm的耐高温蒸煮袋中并进行真空封口，置于水面以下进行超声波处理后取出，放入80℃水浴锅中水浴加热，当牛肉中心温度达到70℃时开始计时，30 min后取出并冷却至室温[7]。

1.3.2 感官评定 参考唐福元[22]、李培红[23]以及周珠法[24]等的评价方法。选择接受过专业训练的人员成立10人感官评定小组，对样品进行感官评价。采用九点评分法，从色泽、气味、形态和口感四个方面对样品进行评分， 每一项指标进行评分后按照其所占权重进行加和得到最终感官评分，其中，每一项指标所占权重分别为色泽20%、气味20%、形态20%、口感40%。

1.3.3 剪切力的测定 将嫩化处理后的样品瘦肉部分顺肌纤维方向切成长方体小块，与肌纤维平行的方向为长，取2 cm，宽和高均为1 cm。每组切取十个样品作为平行，使用TA-XT2i质构仪进行剪切力测定。选择HDP/BSK探头，设置测定参数如下：测前、测中及测后速度均为2.00 mm/s，压缩距离40 mm，平行测定十次，取平均值。

1.3.4 单因素试验 按参考文献[24， 25]进行预试验后，将pH设为固定值7.0，以处理温度、酶用量、超声波时间、超声波功率为影响因素进行单因素试验，考察各因素对嫩化后牛肉剪切力和感官评分影响。

固定酶用量15 U/g，超声波时间30 min，超声波功率150 W，考察不同处理温度（30、40、50、60、70℃）对牛肉剪切力和感官评分的影响。

固定处理温度50℃，超声波时间30 min，超声波功率150 W，考察不同酶用量（5、10、15、20、25 U/g）对牛肉剪切力和感官评分的影响。

固定处理温度50℃，酶用量15 U/g ，超声波功率150 W，考察不同超声波时间（10、20、30、40、50 min）对牛肉剪切力和感官评分的影响。

固定处理温度50℃，酶用量15 U/g，超声波时间30 min，考察不同超声波功率（50、100、150、200、250 W）对牛肉剪切力和感官评分的影响。

1.3.5 响应面优化试验设计 在单因素试验结果的基础上，运用Box-Behnken中心试验设计原理，筛选木瓜蛋白酶用量、处理温度和超声波功率三个变量作为影响牛肉嫩度的主要因素，以剪切力作为相应值，进行三因素三水平响应面设计试验。响应面因素设计如表2，超声波时间设置为20 min。

1.3.6 牛肉微观结构的倒置荧光显微镜观察 设3个处理：（a）未处理；（b）酶用量16 U/g，51℃水浴，20 min嫩化处理；（c）酶用量16 U/g，51℃水浴，超声波功率151 W，超声波时间20 min嫩化处理。将3组样品的瘦肉部分分别沿肌纤维的纵切面和垂直于肌纤维的横切面进行冷冻切片，厚度为8.0 mm，置于倒置荧光显微镜下进行微观结构观察，考察单独酶嫩化处理以及超声波辅助酶嫩化处理对牛肉瘦肉部分微观结构的影响。

1.3.7 数据分析 利用SPSS 19.0软件对试验结果进行方差分析和显著性检验，多重比较采用Duncans法，P<0.05表示差异显著。响应曲面设计及数据分析采用Design-expert 8.0.6软件进行。采用Origin 8.5进行作图。

2 结果与分析

2.1 单因素試验结果

2.1.1 木瓜蛋白酶用量对牛肉嫩化效果的影响 由图1可知，当酶用量逐渐增加时，牛肉的剪切力呈下降趋势，尤其是在酶用量为5～20 U/g 的范围内，剪切力下降速率比较快，当酶用量大于20 U/g时，剪切力变化趋于平缓，没有显著性差异。而牛肉的感官评分随酶用量增大呈现先增加后降低的趋势，原因是当酶用量增大到15 U/g时剪切力为3 882.34 g，与对照组（7 629.16 g）相比降低了49.1%，此时硬度有一定的改善，口感等正合适，感官评分达到最高值8.27，而当剪切力继续降低时牛肉的组织结构会由于过度嫩化而导致色泽变差、口感过软等问题，感官评分降低。这与周珠法[24]的研究结果一致。综合剪切力值和感官评分两个指标，选择木瓜蛋白酶的最佳用量为15 U/g。

2.1.2 处理温度对牛肉嫩化效果的影响 由图2可知，当处理温度在30～50℃时，牛肉剪切力随温度的升高呈迅速下降趋势，感官评分则逐渐升高，当温度为50℃时剪切力达到最低值3 863.85 g，这与王晶等[26]的研究结果比较一致，此时牛肉的感官评分最高，为8.36；而当温度高于50℃后，剪切力隨温度的增加而逐渐增大。因为温度过高，超过了木瓜蛋白酶作用的最适温度，酶开始变性失活。由于剪切力增加，牛肉的嫩度下降，咀嚼性、硬度等较差，感官评分逐渐降低。故选择50℃为最佳处理温度。

2.1.3 超声波功率对牛肉嫩化效果的影响 由图3可知，当超声波功率逐渐变大时，牛肉的剪切力呈先下降后上升的变化趋势，在150 W时达到最低值3 940.53 g，此趋势与唐福元等[22]的研究结果相似。黄六容等[16]研究发现，在低功率超声波（0～300 W）作用条件下，木瓜蛋白酶活性随超声波功率的增加呈现先上升后下降的趋势，超声波功率为40 W时酶活性达到最大，而超声波功率过高时会破坏酶的结构，使其活性下降甚至彻底失活。本研究中超声波功率为150 W时嫩化效果最好，与其超声波40 W时木瓜蛋白酶活性最大不太一致。可能是因为本研究是将酶注射到牛肉中进行反应的，而不是直接将酶暴露在超声波的作用中，肉对酶可能具有一定的保护作用。感官评分在功率150 W时也达到最大值8.13，故选择150 W作为最佳超声波功率进行以下试验。

2.1.4 超声波时间对牛肉嫩化效果的影响 由图4可知，牛肉剪切力随超声波时间增加而逐渐降低，感官评分逐渐升高，但是当超声波时间大于20 min时，剪切力和感官评分的变化均无显著性差异（P>0.05）。夏军军等[7]运用响应面法对酶嫩化牛肉的工艺进行优化时发现，影响剪切力因素的主次顺序为：温度>酶用量>时间。赵立等[4]采用响应面法优化超声波嫩化鸭肉工艺时发现，影响鸭肉嫩度因素的主次顺序为：温度>超声波功率>超声波时间，且超声波时间对剪切力没有显著性影响（P>0.05）。因此，以下进行响应面设计时将超声波时间设为20 min。

2.2 响应面优化试验结果分析

2.2.1 响应面试验设计及结果 由单因素试验结果可以发现，牛肉的剪切力值和感官评分的变化趋势相关。当剪切力值最小时，感官评分一般是最高的；而当剪切力值较大时，感官评分一般比较低。因此，采用能通过试验比较精确得到的剪切力值作为相应值进行响应面优化试验，优化试验结果见表3。

2.2.2 回归模型的建立及方差分析 通过Design-expert 8.0.6软件对剪切力和各因素进行逐步回归拟合，得到超声波辅助木瓜蛋白酶嫩化牛肉工艺中剪切力（Y）与酶用量（A）、处理温度（B）和超声波功率（C）三个因素之间的多元二次回归方程，如下：

Y=3950.99-202.10A-91.42B-38.91C+27.05AB+26.62AC+53.53BC+486.30A2+415.50B2+464.93C2

由表4可以看出，回归模型P<0.0001，说明构建的预测模型极显著。失拟项P>0.05，差异不显著，说明该方程能较好地描述各嫩化条件与牛肉剪切力之间的关系。该模型的R2=0.9563，表明此模型能够解释响应面中95.63%的可变性，可用于优化牛肉嫩化条件。由F值大小可以得到影响剪切力的各因素主次顺序为：酶用量（A）>处理温度（B）>超声波功率（C），其中一次项因素中A、B对剪切力影响极显著（P<0.01），C对剪切力影响显著（P<0.05），交互项中BC对剪切力影响显著（P<0.05），平方项中A2、B2、C2对剪切力的影响均为极显著（P<0.01）。

2.2.3 响应面中各因素间交互作用分析 根据以上得到的回归方程，使用Design-expert 8.0.6 软件对表4中的数据进行多元回归拟合，得到各因素交互效应的响应面图及等高线，如图5所示。剪切力由等高线的中心区域向边缘区域逐渐增大，中心区域剪切力最大。BC交互作用响应面的凹陷程度大于AB和AC交互作用，表明BC交互作用对剪切力的影响更大。这与上述方差分析的结果是一致的，即当酶用量为15 U/g、超声波时间为20 min时，处理温度和超声波功率的交互效应对牛肉的剪切力值有显著影响（P<0.05），而其他的交互效应影响不显著（P>0.05）。整体来说，当其中两个因素为固定值时，变量因素均呈现先降低后升高的趋势。

2.2.4 最优工艺参数的确定及验证 通过Design-expert 8.0.6 软件分析，得到优化后的最佳工艺参数为：酶用量16.02 U/g，处理温度51.01℃，超声波功率151.47 W，超声波时间20 min，此条件下嫩化的牛肉剪切力为3 925.14 g。为了操作方便，将实际的最佳工艺参数调整为：酶用量16 U/g，处理温度51℃，超声波功率151 W，超声波时间20 min。利用此条件嫩化牛肉进行验证试验，得到的牛肉剪切力值为3 887.21 g，与模型预测值接近，与未嫩化处理组（7 629.16 g）相比剪切力降低了49.0%，与不加超声波而其他条件相同的单独酶嫩化处理组（4 663.42 g）相比降低了16.6%，均具有显著性差异（P<0.05）。证明该优化后的实际工艺条件可靠合理。

2.2.5 嫩化对牛肉微观结构的影响 图6比较了未嫩化处理、酶嫩化处理以及超声波辅助酶嫩化处理三组牛肉瘦肉部分横切面和纵切面在倒置荧光显微镜下的微观结构。由纵切面图（A）可以看出，未嫩化处理的牛肉肌纤维结构完整，而经过嫩化处理的牛肉肌纤维结构断裂明显，且超声波辅助木瓜蛋白酶嫩化的牛肉比单独使用木瓜蛋白酶嫩化的牛肉肌纤维结构断裂的片段更小且比较均匀，证明超声波辅助木瓜蛋白酶对牛肉的嫩化效果更均匀。由横切面图可以看出，未嫩化处理的牛肉肌纤维束之间的结构比较致密，中间比较大的不均匀空洞可能是因为冷冻切片时对牛肉的结构造成了一定破坏而出现的，而嫩化处理后的牛肉肌肉纤维结构变得比较疏松，肌纤维之间出现了很多间隙，密度变小，且超声波辅助木瓜蛋白酶处理的样品比木瓜蛋白酶单独处理的样品间隙更多更大，而且更均匀，这与纵切面的结果是一致的。

3 结论

本试验通过单因素试验和响应面法对超声波辅助木瓜蛋白酶嫩化牛肉的条件进行优化，得到的响应面模型效果极显著（P<0.01）。由回归方程确定的最佳工艺参数为：木瓜蛋白酶用量16.02 U/g，处理温度51.01℃，超声波功率151.47 W，超声波时间20 min，考虑到实际操作条件将最佳工艺参数修正为酶用量16 U/g，处理温度51℃，超声波功率151 W，超声波时间20 min。最佳工艺参数下嫩化得到的牛肉剪切力值为3 887.21 g，与模型预测值3 925.14 g相近，表明模型比较可靠。其与对照组（7 629.16 g）相比剪切力降低49.0%，与不加超声波而其他条件相同的单独酶嫩化处理组（4 663.42 g）相比降低了16.6%，均具有显著性差异（P<0.05）。另外结合牛肉瘦肉部分横切面和纵切面的微观结构观察，可知超声波确实具有嫩化牛肉的效果，且辅助酶嫩化时可以提高整体的均匀性，同时此工艺在一定程度上减少了酶用量，缩短了嫩化时间，可以为肉制品的嫩化工艺提供一定的参考和依据。

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