新型Streptomyces sp.N2代谢粗提物的抑菌活性及其水果保鲜初探

吴志明，鹿承建，章帅文，祁增兴，朱曼宁，李昆太

(江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室/江西农业大学生物科学与工程学院，江西 南昌 330045)

【研究意义】目前，抗生素滥用导致各种病害产生耐药或抗药性，严重危害农业和食品的生产安全，甚至威胁人类生命健康[1]。因此，在绿色、安全生态日趋受全球关注的时代，愈发需要新型高效、广谱安全和低毒环保的拮抗微生物来抑制或杀死有害微生物，为农业、食品和医疗领域的可持续发展提供有力保障[2-3]。【前人研究进展】放线菌是许多胞外酶和抗生素的知名生产者，尤其是链霉菌属[4-5]凭借易分离培养、产多种次级代谢物等特点，被广泛应用于农业病害防治、食品防腐和医学领域，如：红霉素[6]，梧宁霉素[7]等。据统计，目前约有60 %的农用抗生素是由链霉菌产生的[8]。其中，吸水链霉菌柠檬色变种(S.hygroscopicusvar.limoneus)产生的井冈霉素(Validamycin A)、可可链霉菌阿索变种(S.cacaoivar.asoensis)产生的多氧霉素(Polyoxins)和灰色产色链霉菌(S.griseochromogenes)产生的灭瘟素(Blasticidin S)已成功运用于农作物的真菌病害防治中[9]；据报道，纳他霉素(Natamycin)是一种广谱高效、被广泛应用于临床和食品工业等领域的二十六元多烯大环内酯类真菌抑制剂，是恰塔努加链霉菌(Streptomyceschatanoogensis)、纳塔尔链霉菌(Streptomycesnatalensis)和褐黄孢链霉菌(Streptomycesgilvosporeus)等经深层发酵产生的次级代谢物[10]。【本研究切入点】本研究先期以水稻纹枯病菌为靶目标，分离筛选到一株产新型抗真菌活性物质(1-甲基-3-氧代-6-氮杂二环[3.1.1]-5(7)-庚烯-2-酮，分子式为C6H7O2N，暂命名为农抗N2)的链霉菌新种Streptomycessp. N2[11]。【拟解决的关键问题】拟通过开展Streptomycessp. N2代谢粗提物拮抗不同植物病原真菌、酵母、G+和G-的活性评价和探索新型Streptomycessp. N2代谢粗提物对离体水果的生防实效及其保鲜作用，为Streptomycessp. N2未来在农业、食品和医药等领域的开发与应用提供有力的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株来源 链霉菌 N2(Streptomycessp.N2)分离自云南省昆明市西山国际森林公园；指示菌(本实验室保存)：革兰氏阳性G+：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，克氏库克菌(MicrococcusKristinae)，苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)；革兰氏阴性G-：恶臭假单胞杆菌(Pseudomonasputida)，水稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzae)，大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)；真菌：酵母菌(Yeast)，辣椒疫病菌(Phytophthoracapsici)，葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)，西瓜枯萎病菌(Fusarriumoxysporumf.sp.niveum)，意大利青霉(Penicilliumitalicum)，黑曲霉(Aspergillusniger)，棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.vasinfectum)，烟草黑胫病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)，指状青霉(Penicilliumdigitatum)，水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)，桔青霉(PenicilliumcitrinumThom)，莴苣菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)，棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)，水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)。

1.1.2 培养基 LB培养基：用于细菌的斜面保存和抑菌活性的检测；PDA培养基：用于真菌的斜面保存和抑菌活性的检测；链霉菌N2发酵培养液：蔗糖40 g，玉米淀粉20 g，玉米浆20 g，黄豆饼粉10 g，(NH4)2SO42 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，MnSO40.01 g，ZnSO40.01 g，H2O 1 L，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌30 min。

1.1.3 仪器与设备 JW-3022HR型高速冷冻离心机，安徽嘉文仪器装备有限公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；LRH-250A生化培养箱，韶关市泰宏医疗器械有限公司；SW-CJ-ID型无菌超净工作台，苏州净化设备有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 N2粗提物的制备 将培养7 d的链霉菌N2孢子刮入30 mL带玻璃珠的无菌蒸馏水中，震荡20 min后移取5 mL孢子悬液于装有50 mL种子培养液的250 mL三角瓶中，160 r·min-1、30 ℃振荡培养48 h即得链霉菌N2种子液。种子液按10 %的接种量转接至含500 mL发酵培养液的2 L三角瓶中，160 r·min-1、30 ℃培养96 h即为链霉菌N2发酵液；链霉菌N2发酵液经两倍体积乙醇(纯度≥90 %)浸提至少24 h后4000 r·min-1离心弃除菌体，上清液以旋转蒸发器浓缩后于10 000 r·min-1离心保留上清液，最后用0.22 μm滤膜过滤除菌即得无菌粗提物原液。用无菌蒸馏水稀释无菌粗提物原液制成不同浓度药液，备用。

1.2.2 N2粗提物抑菌谱的测定 参考文献[12]测定N2粗提物对12种待测植物病原真菌的抑制作用，处理组：200 mLPDA与15 mLN2粗提物原液混匀制成含药平板(Φ90 mm)，用Φ9mm无菌打孔器制取菌块置于平板中央，以含等量无菌水为对照，每个处理重复5次，28 ℃恒温培养3 d后测量菌落直径，计算抑制率。

参考文献[13]测定N2粗提物对供试酵母菌、革兰氏阳性G+和G-菌的抑菌活性，用50 mL无菌水将待测指示菌制成菌悬液后，移取200 μl均匀涂布于相应固体培养基上，15 min后小心放入无菌牛津杯，加入200 μl不同浓度N2粗提物。以无菌水为CK对照，各处理重复3次，24 h后测量抑菌圈直径并记录。

1.2.3 建立N2粗提物对不同植物病原真菌的毒力回归方程及其MIC的测定 参考文献[14]测试植物病原真菌对N2粗提物的敏感性以及N2粗提物相应的最低抑菌浓度MIC：将不同浓度无菌N2粗提物与冷却至60 ℃的PDA培养基混匀制成系列浓度的含药平板后，采用1.3.2中的方法接种和培养不同植物病原真菌，每处理3～5次重复，观察菌丝生长情况并采用十字交叉法测量菌落直径，利用DPS统计软件，采用剂量对数-抑菌率机率值法建立毒力回归方程，计算EC50；以72 h后抑制病原菌生长的最低药物浓度为MIC。

1.2.4 N2粗提物对离体果实的生物防效测定 经75 %酒精和1 %次氯酸钠表面消毒后的健康猕猴桃(随机挑选、大小一致)，采用有伤接种的方式将活化后的葡萄座腔菌接种于果实赤道部位一侧, 喷施5 mL不同浓度的N2粗提物，并用湿润的无菌棉花盖住伤口，以均不喷药但分别接种病原菌和无菌PDA块为CK和阴性对照组。置于(25±2)℃恒温保湿(相对湿度75 %)培养箱中7 d。观察并记录猕猴桃染病面积，参考公式:相对防效(%)=(CK处理组感病面积-药液处理组感病面积)×100 %/CK处理组感病面积。

1.2.5 N2粗提物对不同水果的保鲜作用 将大小、成熟度一致的广西金黄圣女果、云南夏黑葡萄和鸡蛋芒果用清水洗净晾干后随机分成3组，处理组: 2.31 μg·mL-1N2粗提物，阳性对照组: 10 μg·mL-1纳他霉素，CK：清水对照。用无菌脱脂棉在待测水果表面均匀涂抹不同处理液后置于保鲜袋中，(30±2)℃恒温保湿贮藏10 d，各处理3次重复，每天称重并计算失重率，同时观察水果颜色、气味和硬度等贮藏品质的变化。

1.2.6 数据处理与分析 采用Excel 2010、DPS 7.05、Origin 9.0和Adobe Photoshop CS5进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 N2粗提物对不同植物病原真菌抑菌率的影响

由表1可见，经农抗N2粗提物处理后12种植物病原真菌的菌落直径较CK组均明显减小，尤以农抗N2粗提物对辣椒疫病菌、葡萄座腔菌、意大利青霉、烟草黑胫病菌和桔青霉的抑制效果较为显著，抑菌率分别达83.58 %、94.55 %、96.24 %、88.96 %和85.49 %；由此进一步验证了农抗N2粗提物中存在广谱拮抗植物病原真菌的活性物质。

2.2 N2粗提物对酵母菌、革兰氏阳性G+ 和G-菌的拮抗作用

通过管碟法测试结果可知(图1)：不同浓度N2粗提物对酵母菌和多种革兰氏阳性、阴性细菌均有显著的抑制效果，且随着浓度的升高抑菌圈直径越大；其中对G+抑制效果最佳为枯草芽孢杆菌，对G-抑制效果最佳为水稻黄单胞菌，当处理浓度为2.88 μg·mL-1时抑菌圈大小分别为：(24.82±2.61)和(25.57±1.43)mm；结合2.1.1结果可知链霉菌N2拥有广谱拮抗的特性，可能存在多种抗菌活性物质。

表1 N2粗提物对不同植物病原真菌抑菌率的影响

注：a中±SD(standard deviation)表示处理间重复的标准差。

Note:aThe results were means±SD (standard deviation) of triplicate determinations.

图1 N2粗提物对酵母菌、G+ 和G-菌的抑菌圈直径Fig.1 Inhibition zone diameters of S. cerevisiae, G+ and G- by N2 crude extract

2.3 8种植物病原真菌对N2粗提物的敏感性和N2粗提物的最低抑菌浓度

EC50是有效反映生防菌拮抗病原菌作用强弱的重要指标，由表2可知，N2粗提物能有效抑制8种供试菌的生长。试验中N2粗提物对8种供试菌的EC50值由小到大依次为：辣椒疫病菌、稻瘟病菌、葡萄座腔菌、莴苣菌核病菌、纹枯病菌、烟草黑胫病菌、棉花枯萎病菌和西瓜枯萎病菌，N2对以上供试菌的MIC值分别为：2.88、2.88、5.77、5.77、5.77、11.53、11.53和13.45 μg·mL-1，与EC50值相符，逐渐变大。

2.4 N2粗提物对离体猕猴桃的生物防效

经离体果实生防试验发现：如图2所示，不同浓度N2粗提物处理后弥猴桃果实感病面积显著小于CK组，相比CK组被葡萄座腔菌侵染了(5.05±0.28)cm2的感病面积，经23.06、115.30 μg·mL-1药液处理后相对防效分别达7.53 %和46.64 %，差异显著；230. 60 μg·mL-1能完全抑制葡萄座腔菌在猕猴桃果实上的感染，同时阴性对照组的离体果实未见感病面积，表明培养环境良好，排除了其他病原菌对本试验的干扰；因此可见，N2粗提物具有显著的生物防效作用。

图中无相同小写字母的表示各处理间差异显著(P<0.05)Different lowercase letters above the columns represent statistically significant (P<0.05) differences among treatments图2 N2粗提物对离体猕猴桃的生物防效Fig.2 The in vitro biocontrol efficacy of N2 crude extract in Actinidia chinensis Planch

2.5 N2粗提物对3种水果失重率的影响

由图3可知，贮藏时间延长，各处理的水果失重率均呈上升趋势，贮藏10 d后圣女果CK失重率为12.62 %，纳他霉素和N2处理组分别为10.04 %和7.34 %，均明显低于CK，与CK差异极显著(P<0.01)；葡萄CK、阳性对照和N2处理组失重率分别为15.89 %、13.68 %和11.62 %，且纳他霉素和N2处理组相比CK差异显著(P<0.05)；而芒果各处理间失重率无显著差异。由此可见，N2粗提物和纳他霉素能有效抑制圣女果和葡萄水分的散失，且2.31 μg·mL-1N2粗提物效果较10 μg·mL-1纳他霉素更佳。

2.6 N2粗提物对3种水果贮藏品质的影响

由图4可见，圣女果和葡萄经N2粗提物和纳他霉素处理10 d后，在贮藏前后相比CK组的果实颜色及其硬度均无显著变化，尤以N2粗提物处理组效果最为明显，且在实验过程中发现随着贮藏时间的延长，CK组中圣女果果蒂脱落、腐烂并伴有恶心臭味，葡萄表面开裂且出现腐斑。芒果经N2粗提物和纳他霉素处理5 d后，相比CK组虽失重率无显著差异，但其贮藏品质明显下降，并随贮藏时间延长芒果表面出现严重腐烂黑斑，散发腐烂味。因此可以推断，N2粗提物中的抑菌活性物质能有效水果样品表面有害菌的生长，提高水果贮藏品质。

表2 8种植物病原真菌对N2粗提物的敏感性和N2粗提物的最低抑菌浓度

图3 N2粗提物对离体水果失重率的影响Fig.3 Effect of N2 crude extract on isolated fruit weight loss rate

图4 N2粗提物对离体水果贮藏品质的影响Fig.4 Effect of N2 crude extract on isolated fruit storage quality

3 讨 论

植物病害是影响作物优质高产和果蔬采后贮藏最重要的制约因素之一，据联合国粮农组织(FAO)统计，每年因植物病害造成的减产损失高达总产量的10 %～15 %[15]。其中，70 %～80 %的植物病害是病原真菌侵染所致[16]。本研究发现，链霉菌N2粗提物对辣椒疫病菌、葡萄座腔菌、西瓜枯萎病菌、意大利青霉、黑曲霉、棉花枯萎病菌、烟草黑胫病菌、指状青霉、水稻纹枯病菌、桔青霉、莴苣菌核病菌、棉花黄萎病菌、水稻稻瘟病菌等多种植物病原真菌均具有较强抑菌活性。此外，链霉菌次级代谢系统复杂，能产生诸多结构新颖、生物活性显著的次级代谢物是链霉菌具备高效、广谱拮抗性的重要原因之一。由研究结果可推测：链霉菌N2代谢粗提物中存在能有效抑制腐败酵母、常见的食品腐败细菌(枯草芽孢杆菌G+、恶臭假单胞杆菌G-)、植物细菌性病害(水稻黄单胞菌G-)和动物致病菌(大肠埃希氏菌G-和克氏库克菌G+)的活性物质。涂国全[17-18]等在以棉花枯萎病为靶标的农用抗生素产生菌的分离筛选中，从棉花地土壤中分离筛选到一株能抑制酵母、G+、G-和霉菌，产多种抗菌物质的链霉菌702。与本研究相似，因此推测Streptomycessp.N2也是一种能分泌多种生物活性物质的生防菌，其次级代谢产物有待进一步开发。

猕猴桃果实腐烂病主要是由葡萄座腔菌、链格孢菌Alternariaalternata、拟茎点霉菌Phomopsismacrospore、富氏葡萄孢盘菌Botryotiniafuckeliana、和层出镰刀菌Fusariumproliferatum引起的真菌性病害，其中B.dothidea不仅能从猕猴桃果实伤口侵入引发病害，更具有从果实表面直接侵入造成腐烂发病的能力[19]。本研究通过离体猕猴桃果实的生物防效试验发现，N2粗提物能显著抑制B.dothidea经伤口侵染猕猴桃果实，防止果实发病。果蔬中的水分是维持生命活动和保持新鲜品质的重要条件，采后贮藏过程中水分的散失是造成果实外观色泽、质地和风味变化的主要原因[20]。试验结果表明，N2粗提物能涂抹处理后能有效降低水果的失重率，保持果实的风味和色泽等贮藏品质，且其效果较纳他霉素更佳。推测可能是N2粗提物在水果表面形成一个半透性薄膜，减缓水果的蒸腾和呼吸作用，抑制有害微生物的入侵和滋生，从而延缓水果保质期。

4 结 论

由此可见，Streptomycessp.N2能有效抑制不同病原菌的生长，其拥有广阔的开发应用前景。但目前针对除农抗N2外的其他Streptomycessp.N2所产活性物质的种类结构、特性及其抑菌机理研究还不清楚，是否本研究中的抑菌和保鲜作用均由农抗N2发挥抑菌作用也有待进一步探索。