抗重金属细菌BCD1的分子鉴定及系统发育分析

乔宏萍，裴梓汝，贺 超，李 闯，许 嘉，张玉荣，崔剑越，王 青

(太原师范学院 生物系，山西 晋中 030619)

水是生命之源，近些年水体污染越来越严重，而重金属积累已成为水污染的重要因素之一.随着矿产、电子、造纸、食品等各种工业的发展，大量的重金属及其化合物随着污水被排放到环境中，造成水资源污染，进而影响动植物，甚至人类身体健康.传统的重金属治理法——物理和化学法，因耗费高，易造成二次污染，而逐渐被生物吸附法所代替.微生物吸附逐渐成为生物吸附重金属污染的重要发展方向，主要是通过微生物(酵母、细菌和藻类等)吸附，在微生物体内对重金属的化学形态进行转变，从而降低毒性.生物吸附法作为成本较低，效率高，对环境影响小的技术，越来越受到各国研究人员的重视[1].本实验室从污水处理厂的污泥中分离筛选出高度耐受重金属镉的细菌BCD1，对其进行形态学，生理生化以及分子生物学的鉴定并进行系统发育树的构建，为进一步研究其吸附机理，将其应用于处理富含重金属的污水奠定一定的理论基础.

1 材料与方法

1.1 菌株：细菌BCD1.

1.2 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，琼脂20 g(液体培养基不加琼脂)，定容至1 000 mL，pH7.0～7.2，121 ℃高压灭菌20 min.

1.3 BCD1的形态学鉴定：观察菌株在牛肉膏蛋白胨固体平板培养基菌落的形态、颜色、大小以及美兰染色后在油镜下观察细菌孢子的形态和大小.

1.4 生理生化指标的测定

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》测定了细菌生长常见的几种常见的生理生化指标，如需氧性和运动性、生长温度(15 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、42 ℃)、耐盐性、淀粉溶解、pH=5.7培养基中生长状况、纤维素分解和明胶液化等.

1.5 分子生物学鉴定

细菌DNA分子的提取采用康为世纪公司试剂盒提取，采用细菌16SrRNA通用引物(SF：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SR：5’-AAGGAGGTGAT CCAGCCGCA-3’)进行PCR扩增.PCR反应体系为：模板DNA 0.2 μM，上下游引物各0.4 μM，2×Taq Master Mix25 μl，加双蒸水补充至50 μl.反应条件为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃终延伸2 min，共30个循环.所得扩增产物用1%的琼脂糖凝胶板，在120 V，60 mA条件下进行电泳检测.

图1 BCD1菌株的细胞形态图 10×100倍光学显微镜

1.6 序列测定与系统发育树分析

经由PCR扩增纯化后得到的16SrRNA，送上海生工基因公司进行测序.对所得序列提交GenBank比对，进行同源性比较，下载9条同源性较高的细菌16SrRNA序列，进行聚类分析，所采用软件为ClustalX(windows-xp-2.0)，并通过MEGA6进行系统发育树的构建.

2 结果与分析

2.1 BCD1的形态学观察

将活化后的菌株BCD1经革兰氏染色为阴性，接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，菌落近圆形凸起，淡黄色，边缘整齐，经美兰简单染色后，在油镜下观察如图1细胞呈短杆菌，1.0～5.0 μm，单个存在.

2.2 生理生化指标的测定

从表1可以看到，菌株BCD1好氧；最低生长温度为15 ℃，最适宜的生长温度为25 ℃～30 ℃，42 ℃几乎不生长；在pH为5.7的培养基中可以生长，具有一定的耐盐性，可以在7%的NaCl培养基中生长，但在10%的NaCl培养基中不能生长；水解淀粉周围变色，为阴性反应；不能分解纤维素和明胶，可以利用葡萄糖、蔗糖、果糖等.

根据1994年伯杰细菌鉴定手册描述：假单胞菌为卵圆形，常单个存在，以极生的多鞭毛运动，对明胶淀粉不水解，专性好氧，可以分解利用葡萄糖果糖等，生长最适温度约25 ℃～30 ℃，41 ℃不生长.从BCD1的培养特征、形态学以及生理生化结果与假单胞菌的菌株非常相似，还需要进一步进行分子生物学鉴定.

表1 生理生化指标的测定

2.3 分子生物学鉴定

将细菌BCD1提取总DNA后，进行PCR扩增得到大约1 500 bp左右的产物，经纯化后送上海生工基因公司测序后，得到1 066 bp的序列.经过Blast比对后与恶臭假单胞菌Pseudomonasputida相似性为100%.通过Sequin提交GenBank后，获得登陆号KY321933.

2.4 系统发育树分析

图2 BCD1菌株的16SrRNA区域序列系统发育树

系统发育树的构建采用clustalX和MEGA6.06_setup软件进行.登陆www.ncbi.nlm.nlh.gov网站，下载了9条常见细菌种类的16SrRNA序列：恶臭假单胞菌(PseudomonasputidaKC422697)、荧光假单胞菌(PseudomonasfluorescensKC495571)、大肠杆菌(Escherichia.coliJ01859)、炭疽杆菌(BacillusanthracisX55059)、克雷伯菌(KlebsiellapneumoniaeJQ003560)、耶尔森菌(YersiniapestisL37604)、霍乱弧菌(Vibrio.choleraeX74694)气单胞菌属(Aeromonas.sp JX839764)和柠檬酸杆菌属(Citrobactersp HE575919).使用NJ法建树后，发现BCD1菌株与恶臭假单胞菌(PseudomonasputidastrainKC422697)聚在一起.

综上所述，通过形态学、生理生化特性和分子生物学鉴定结果，可以初步确定BCD1为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida).

3 结论与讨论

耐重金属细菌BCD1无论在形态学，生理生化特性都与假单胞菌属的特征非常相似，通过分子生物学鉴定后比对发现与恶臭假单胞菌的相似性可以达到100%，聚类分析二者也聚在一个分支，从而可以确定BCD1为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida).

近年来吸附重金属的细菌报道[1-7]的主要有假单胞属(Pseudomonas.sp)、芽孢杆菌属(Bacillus.sp)、柠檬酸菌属(Citrobacter.sp)、大肠杆菌属(E.coli)以及链霉菌属(Streptomyces.sp)等，它们可以通过产生多糖、蛋白等物质吸附重金属离子，也可以将重金属离子与热蛋白等结合转化为无毒性或低毒性的离子，或者微生物可以产生氧化还原酶，催化金属离子进行氧化还原反应从而改变其性质等.不同的微生物具有不同的吸附功能，本试验获得的吸附镉的细菌BCD1通过鉴定后属于假单胞属，在后续的机理和应用研究中可以根据菌种的特性进行.