p38MAPK信号通路的抑制减轻缺氧复氧环境下心肌细胞凋亡

李越凡，徐丹，李婷，朱为勇

据统计，每年全球范围内超过720万人死于冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病），其严重危害着人类的生命健康。心肌梗死后最为有效方法是恢复心肌血液流通，冠状动脉旁路移植术、溶栓等是目前常用的恢复心肌缺血再灌注的有效方法[1]。当心肌缺血再灌注后常会出现心肌组织损伤加重、心力衰竭等现象，严重者会导致死亡，这称为心肌缺血再灌注损伤。氧化应激、心肌细胞大量凋亡等是其发生的主要原因[2-5]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路参与细胞生长过程，是细胞信号转导的重要调节通路之一，p38MAPK是MAPK的成员之一，在细胞增殖、分化、凋亡、死亡、迁移等多种生物学特性中有广泛的调控作用[6-9]。有研究表明，p38MAPK在心肌梗死组织中过度激活，其磷酸化水平升高，致细胞炎症因子聚集，使心肌细胞凋亡增加[10,11]。之前的研究表明，15 μmol/L的p38MAPK特异性抑制剂SB203580（SB）能够特异性的抑制p38MAPK磷酸化[12,13]。本研究通过体外构建心肌细胞缺氧复氧模型，探讨p38MAPK信号通路抑制剂对缺氧复氧心肌细胞凋亡的影响，以期为靶向抑制p38MAPK信号通路治疗心肌缺血再灌注损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料心肌细胞H9C2购自中科院上海细胞库。活性氧（ROS）含量检测试剂盒（DCFH-DA法）购自于碧云天生物技术研究所；超氧化物歧化酶（SOD）含量检测试剂盒（黄嘌呤氧化法）购自于为上海纪宁生物科技有限公司；乳酸脱氢酶（LDH）含量试剂盒（二硝基苯肼显色法）购自于南京建成生物工程研究所；丙二醛（MDA）含量检测试剂盒（硫代巴比妥酸比色法）购自于南京森贝伽生物科技有限公司；p38MAPK多克隆抗体、p-p38MAPK多克隆抗体、β肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体、Cleaved Caspase-3多克隆抗体均购自于美国Abcam；p38MAPK特异性抑制剂SB203580、胰蛋白酶均购自美国Sigma；胎牛血清购自于美国Gibco。

1.2 心肌细胞培养将保存在液氮中的H9C2细胞取出，放置于37℃水浴中，观察细胞融化后，用细胞培养液（含10%胎牛血清的DMEM）悬浮细胞，1000 r/min离心10 min，弃上清液，用5 ml的细胞培养液重悬细胞后，种植于细胞培养瓶中，在37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中培养，待细胞融合度超过85%时，将细胞培养液倒掉，用0.25%的胰蛋白酶在37℃消化细胞2 min，1000 r/min离心10 min，弃上清液，用5 ml的细胞培养液悬浮细胞，按照1:3的比例种植到细胞培养瓶中继续培养。

1.3 缺氧复氧模型构建缺氧复氧模型构建：H9C2细胞在37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中培养，观察细胞密度超过80%时，将细胞培养液更换为不含有胎牛血清的培养液，放在1%O2，94% N2，5%CO2缺氧培养箱中孵育12 h。弃培养液，加入含有10%胎牛血清的细胞培养液，在37℃，20%O2，5%CO2培养箱中培养4 h。H9C2细胞分为Con组、H/R组、SB203580组。其中Con组细胞正常培养，不进行缺氧复氧处理；H/R组、SB203580组进行缺氧复氧处理，SB203580组细胞在缺氧复氧前用15μmol/L的p38MAPK特异性抑制剂SB203580预处理24 h。

1.4 MTT检测细胞增殖H9C2细胞培养至对数期后，调整细胞浓度为每毫升含有105个细胞，接种到96孔板中，每孔中加入100 μl的细胞悬浮液，培养过夜。按照Con组、H/R组、SB203580组分组，每组设置5个复孔，以不加细胞的孔为空白组，用于调零。按照3.3中方法处理各组细胞，待细胞复氧后，在每孔中加入20 μl的5 mg/ml的MTT溶液，在37℃孵育4 h，吸取培养液，加入二甲基亚砜溶液150 μl，反应10 min，用酶标仪检测每孔的OD值，分析计算细胞存活率。细胞存活率=100%×（实验组OD值-空白组OD值）÷（Con组OD值-空白组OD值）

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡Con组、H/R组、SB203580组细胞按照3.3中方法处理后，待细胞复氧后，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，用PBS调整细胞浓度为每毫升含有6×105个细胞，收集1 ml细胞悬浮液，1000 r/min离心10 min，弃上清液，在细胞沉淀中加200μL结合缓冲液重悬，依次加入5 μl膜联蛋白 V-FITC（Annexin V-FITC）和5 μl碘化丙啶（Propidium Iodide，PI），放置于室温避光条件下孵育15 min ，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 LDH、SDH、SOD、ROS含量检测Con组、H/R组、SB203580组细胞按照3.3中方法处理后，待细胞复氧后，收集各组细胞培养液上清液及细胞，用二硝基苯肼显色法检测上清液中LDH含量，用硫代巴比妥酸比色法检测心肌细胞中MDA含量，用黄嘌呤氧化法检测细胞中SOD含量，DCFH-DA法检测细胞中ROS含量。检测步骤分别参照LDH、MDA、SOD、ROS含量检测试剂盒。

1.7 Western blot检测p38MAPK、p-p38MAPK、Cleaved Caspase-3表达Con组、H/R组、SB203580组细胞按照3.3中方法处理后，待细胞复氧后，将细胞培养液吸除后，加入裂解液充分裂解，转移至离心管中，14000 r/min，4℃离心10 min。将蛋白上清液吸取至新的EP管中，用BCA蛋白定量检测试剂盒检测蛋白浓度。将蛋白样品与等体积的2×Loading buffer在100℃煮沸5 min后进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳：每孔加入50 μg变性蛋白，浓缩胶中电压为80 V，分离胶中电压为120 V。转膜：90 V电压，4℃转膜70 min。封闭：5%牛血清白蛋白室温封闭60 min。一抗孵育：1:800倍稀释，4℃反应过夜。二抗孵育：1:1000倍稀释，室温孵育60 min。显色，凝胶成像分析仪采集图像，分析蛋白表达水平。蛋白表达水平=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值

1.8 统计学处理所有实验重复3次，取平均值。所得的实验数据均采用SPSS 22.0统计学软件分析，数据以均数±标准差（±s）表示，多组间数据比较采用单因素方差进行分析，两组数据比较用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SB203580在缺氧条件下恢复细胞增殖Con组、H/R组、SB203580组细胞存活率依次为：（100.43±8.57）%、（52.49±6.62）%、（75.17±6.37）%。H/R组、SB203580组细胞存活率均明显低于Con组，差异具有统计学意义（tH/R=7.668，PH/R＜0.01，tSB=4.097，PSB＜0.05）。SB203580组细胞存活率明显高于H/R组，差异具有统计学意义（t=4.276，P＜0.05）（图1）。

2.2 SB203580在缺氧条件下减少细胞凋亡Con组、H/R组、SB203580组细胞凋亡率依次为：（4.41±0.91）%、（33.12±3.47）%、（12.24±2.40）%。H/R组、SB203580组细胞凋亡率均明显高于Con组，差异具有统计学意义（tH/R=13.862，PH/R＜0.01，tSB=5.284，PSB＜0.01）。SB203580组细胞凋亡率明显低于H/R组，差异具有统计学意义（t=8.572，P＜0.01）（图2）。

2.3 SB203580在缺氧条件下恢复MDA水平Con组、H/R组、SB203580组MDA含量依次为：（0.39±0.67）mmol/L、（2.12±0.14）mmol/L、（1.25±0.07）mmol/L。H/R组、SB203580组MDA含量明显高于Con组，差异具有统计学意义（tH/R=20.580，PH/R＜0.01，tSB=18.476，PSB＜0.01）。SB203580组MDA含量明显低于H/R组，差异具有统计学意义（t=9.406，P＜0.01）（图3）。

图2 细胞凋亡检测结果

图3 细胞中MDA含量

2.4 SB203580在缺氧条件下降低细胞ROS水平，恢复SOD水平荧光强度越高表示ROS水平越高。Con组、H/R组、SB203580组荧光强度（ROS水平）依次为：78.19±7.17、277.72±24.25、180.78±17.68，SOD含量依次为：（165.36±9.89）U/mL、（89.44±8.79）U/mL、（130.23±8.97）U/mL。H/R、SB203580组ROS含量均明显高于Con组，SOD含量均明显低于Con组，差异均有统计学意义（tH/R-ROS=13.667，PH/R-ROS＜0.01，tSB-ROS=9.314，PSB-ROS＜0.01，tH/R-SOD=10.961，PH/R-SOD＜0.01，tSB-SOD=4.557，PSB-SOD＜0.05）。SB203580组ROS含量明显低于H/R组，而SOD含量明显高于H/R组，差异均具有统计学意义（tROS=5.595，PROS≤0.01，tSOD=6.280，PSOD＜0.05）（图4）。

2.5 SB203580在缺氧条件下减少LDH外漏Con组、H/R组、SB203580组LDH含量依次为：（25.39±4.76）U/L、（95.21±6.14）U/L、（58.44±5.56）U/L。H/R组、SB203580组LDH含量均明显高于Con组，差异有统计学意义（tH/R=15.566，PH/R＜0.01，tSB=7.821，PSB＜0.01）。SB203580组LDH含量明显低于H/R组，差异具有统计学意义（t=7.689，P＜0.01）（图5）。

2.6 SB203580在缺氧条件下降低p-p38MAPK、Cleaved Caspase-3水平Con、H/R、SB203580组p38MAPK水平依次为：0.83±0.08、0.82±0.04、0.84±0.06，p-p38MAPK水平依次为：0.12±0.04、0.28±0.02、0.19±0.01，Cleaved Caspase-3水平依次为：0.15±0.03、0.76±0.06、0.35±0.04。H/R、SB203580组p-p38MAPK、Cleaved Caspase-3水平均明显高于Con组，差异具有统计学意义（tH/R-p-p38MAPK=6.197，PH/R-p-p38MAPK＜0.01，tSB-p-p38MAPK=2.941，PSB-p-p38MAPK＜0.05，tH/R-Cleaved Caspase-3=15.750，PH/R-Cleaved Caspase-3＜0.01，tSB-CleavedCaspase-3=6.928，PSB-CleavedCaspase-3＜0.01）。SB203580组p-p38MAPK、Cleaved Caspase-3水平明显低于H/R组，差异具有统计学意义（tp-p38MAPK=6.971，Pp-p38MAPK＜0.01，tCleavedCaspase-3=9.848，PCleavedCaspase-3＜0.01）（图6）。

图4 细胞中ROS和SOD含量

图5 培养液上清中LDH含量

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤的发生与氧化应激、钙离子超载、炎症反应、心肌细胞凋亡等有关[14]。研究表明，心肌缺血后，恢复冠状动脉血液流通时，动脉血会将氧转运至缺血区，心肌细胞产生大量的ROS，引起氧化应激，加重心肌损伤，造成心肌细胞凋亡[15,16]。p38MAPK信号通路能够调控心肌细胞、血管内皮细胞、软骨细胞等多种细胞的生长和信号传递过程，参与心肌缺血再灌注、心室重构、动脉粥样硬化等多种心血管系统疾病的发生[17-19]。研究表明，p38MAPK在心肌梗死组织中磷酸化水平升高，p38MAPK信号通路抑制剂可以改善心肌缺血再灌注损伤[20,21]。p38MAPK信号通路磷酸化后生成p-p38MAPK发挥促进细胞凋亡的作用[22]。

图6 细胞中p38MAPK、p-p38MAPK、Cleaved Caspase-3蛋白表达

心肌缺血再灌注损伤发生时会伴随大量的心肌细胞凋亡。细胞凋亡的发生与多种细胞因子的调控有关，Caspase蛋白家族是目前公认的与细胞凋亡有关的凋亡相关蛋白，其激活后能够促进细胞凋亡的发生[23,24]。Caspase-3是Caspase蛋白家族的成员之一，正常情况下以酶原的形式存在，当其活化后形成Cleaved Caspase-3后标志着细胞凋亡进入不可逆阶段[25-28]。本研究结果显示，缺氧复氧后的心肌细胞凋亡率大大增加，细胞存活率明显降低，细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平升高，而p38MAPK信号通路抑制剂作用后的心肌细胞凋亡率下降，细胞存活率升高，细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平降低。提示p38MAPK信号通路抑制剂能够部分逆转缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡。

正常情况下，细胞中氧化和抗氧化水平处于动态平衡状态，当细胞中氧自由基不能及时清除而造成氧自由基异常聚集，最终会引起氧化应激[29-32]。低浓度的ROS能够维持细胞中正常的信号转导，而ROS异常增多会导致细胞产生氧化应激，引起细胞凋亡发生[33-35]。SOD属于抗氧化系统的蛋白酶，能够特异性的清除机体内氧自由基，是氧自由基的天然清除剂[36,37]。当细胞发生氧化应激后，细胞内的脂质发生过氧化，破坏细胞膜通透性，使细胞浆内的LDH外漏，而MDA是脂质过氧化的产物[38-40]。本研究结果显示，缺氧复氧后心肌细胞中ROS、MDA水平升高，而细胞中SOD水平下降，培养液上清液中LDH含量升高，而p38MAPK信号通路抑制剂处理后能够部分逆转这一现象。这提示，p38MAPK信号通路抑制剂可以减轻缺氧复氧诱导的心肌细胞氧化损伤。

综上所述，p38MAPK信号通路抑制剂能够改善缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡和氧化损伤，为后续进一步探讨p38MAPK信号通路在心肌缺血再灌注损伤中的作用奠定了基础，为靶向p38MAPK信号通路治疗心肌缺血再灌注损伤提供了理论依据。本研究存在一定的局限性，只探讨了p38MAPK信号通路对缺氧复氧心肌细胞凋亡及氧化损伤的作用，后续试验中会进一步探讨其对心肌缺血再灌注炎症因子、钙超载等的影响。