副溶血性弧菌恒温荧光法检测及快速检测试剂盒的初步应用

杨家齐　田明胜　朱智　殷荣永　钟少水　唐皓轩　邵雪阳　倪培恩　王大鹏　张文敏　石育娇　戚成　冯元琦　何更生

摘要：【目的】采用恒温荧光PCR方法及快速检测试剂盒对副溶血弧菌的扩增结果进行实时检测，并对其检测限、灵敏度及特异度等进行测试。

【方法】通过三个实验阶段（实验室自配阳性样品测试阶段、腹泻病人模拟生物样本测试阶段、市场食品样测试阶段），验证仪器及试剂盒的稳定性、对腹泻样本和市场食品样本检测的可靠性，及其适用范围。

【结果】实验室自配样品检测结果较好，检测限达到7～100 cfu/mL；腹泻样和市场食品样的检测假阳性率较高，但灵敏度极好，三个阶段合计灵敏度为99.6%，特异度为55.9%，真阳性率为85.1%，真阴性率为98.3%。

【结论】该恒温荧光PCR方法及快速检测试剂盒灵敏度高，稳定性好，适用范围广，在控制实验操作过程及实验条件，提高特异度后，值得进一步推广，对我国食源性副溶血性弧菌的检测具有重要意义。

关键词：副溶血性弧菌；恒温荧光PCR；快速检测试剂盒

中图分类号：R115 文献标志码：A

副溶血弧菌（Vibio parahaemolyticus，VP）是一种革兰阴性的弯曲棒状菌，具有嗜盐性，主要存在于近海岸的海水、海水沉积物及浮游生物、鱼、虾、蟹、贝类等海产品中[1]，是海产品常见的致病菌，被列为全球最重要的食源性病原菌之一[2]。副溶血弧菌感染主要临床表现为上腹部阵发性绞痛，呕吐，腹泻，水样便（有时脓血便）等胃肠道症状，重症者可能出现脱水、意识不清、血压下降等。世界首例报道的副溶血弧菌食物中毒是1950年10月发生于日本大阪的沙丁鱼中毒事件，造成272人中毒，20人死亡[3]。此后，副溶血弧菌中毒在世界各地报道屡见不鲜。1992—2001年间，我国13个监测地区上报的5.000余例食源性疾病中，微生物引起的食物中毒占38.5%，其中副溶血弧菌占了31.1%，超过沙门氏菌成为首要病原菌[4]。因此，研究副溶血弧菌的快速、准确的检测方法非常重要。

目前对副溶血弧菌的检测主要为分子生物学方法和分析化学方法，从细胞水平和分子水平来检测副溶血弧菌，包括PCR检测和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法等[5]。国标（GB 4789.7—2013）对副溶血弧菌的检测包括生化试验及血清学试验或神奈川试验，需在3%氯化钠碱性蛋白胨水内增菌后，在3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板纯培养18～24 h，神奈川试验还需接种在我妻氏血琼脂平板培养不超过24 h[6]，整个过程需要5～7 d，培养过程较长，实验过程较繁琐，耗时较久。

本研究以微生物基因组计划（Microbial Genome Program，MGP）为背景，在传统PCR方法的基础上，应用恒温荧光PCR方法及快速检测试剂盒对副溶血弧菌进行检测，该方法无需热循环，持续扩增，使用Bst DNA聚合酶，高效扩增，引物成哑铃状，存在茎环结构，能自主扩增，另外反应底物浓度高，能提高低拷贝模板的扩增概率。并且该恒温荧光法用于现场副溶血性弧菌检测，操作便捷，检出迅速，具有一定优势[7]。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

恒温扩增荧光检测仪（Deaou-308C），相关快速试剂盒—副溶血弧菌核酸恒温检测试剂盒（产品编号：FA101S；包装规格：24测试/盒）。试剂盒内包括Bst DNA聚合酶，反应缓冲液，密封液，阴性对照，阳性对照，DNA提取液；细菌基因组DNA快速提取试剂盒。以上仪器与试剂均由广州迪澳生物科技有限公司提供。恒温扩增荧光检测仪（Deaou-308C）采用安卓系统，30 s一次实时监测，内置触摸屏，采用数学模型进行数据处理和图形绘制，可自动判读结果，阳性结果成S型曲线。

标准副溶血弧菌菌株ATCC17802，由上海理工大学医疗器械与食品学院实验室培养。

1.2 扩增基因的引物序列

用于基因扩增的引物序列，即LAMP引物序列见表1。

1.3 实验方法

实验分为三个部分：实验室自配样品测试阶段，腹泻样本检测阶段，市场食品样本检测阶段。实验室自配样品测试阶段是为了测试机器及试剂的稳定性及试剂的最低检测限；腹泻样本及市场食品样本检测阶段是为了测试机器及试剂针对不同样本的适用范围与检测准确度。实验三个部分的样品均分发至复旦大学公共卫生学院营养教研室实验室、上海理工大学医疗器械与食品学院实验室、上海交通大学农业与生物学院实验室进行平行检测。

反应体系操作流程如下：

① DNA模板制备：将样品增菌液摇匀稍静止，取增菌液1 mL，10.000 r/min离心3 min，弃净上清液；涡旋混匀DNA提取液，向沉淀中加入100μL DNA提取液，涡旋混匀，100℃加热5 min；10.000 r/min离心3 min，将上清转移至新的离心管备用，即为模板。

② 反应体系配制：若有n个待检样品，需配制n+2個反应液（n个待检样品+1个阴性对照+1个阳性对照），将试剂在EP管中混匀，按每管23 μL分装至0.2 mL PCR管中，分别向每管中加入20 μL的密封液。

③ 加样：在上述含有混匀试剂的PCR管中加入2 μL模板（加样顺序为阴性对照、待检样品、阳性对照），盖好管盖，10.000 r/min离心30 s。

④ 扩增反应：63℃反应45 min。

结果判定：若有“S”型扩增曲线且出峰时间<30 min，则判断为阳性，含有副溶血弧菌；若有“S”型扩增曲线且出峰时间≥30 min，则判断为可疑样本；若无“S”型扩增曲线，则判断为阴性，不含有副溶血弧菌或含量低于检测限。

2 验证过程

2.1 实验室自配阳性样品测试阶段

副溶血性弧菌（ATCC 17.802）于（4±0.5）℃冰箱中的固体培养基上保藏。临用前从固体培养基上取一环菌苔，接种于液体培养基中，于37℃、110 r/min的摇床上过夜培养。将过夜培养的副溶血弧菌悬液用液体培养基进行系列稀释，分别稀释至100，1.000，10.000，100.000 cfu/mL，每个浓度2份，加之阴性样本2份，共10份，每份平均分成3份，得到副溶血性弧菌样品30份（24份阳性，6份阴性），平均分发至三个实验室，每个实验室按平行双样测试对其中10份样品进行检测。

2.2 腹泻病人生物样本模拟测试阶段

由于副溶血弧菌感染起病急，对于体弱的患者，感染引发的败血症会有危及生命的危险，其进入患者血液并分布到全身的过程引起败血症，最终会导致失血性休克、全身性多器官衰竭甚至死亡[8]。研究表明，上海市居民每人每天通过水产品摄入导致副溶血弧菌感染的概率均值为1.2×10-6，按《2014上海统计年鉴》中上海市常住人口2.415万人计，上海市居民每年通过食用水产品导致致病性副溶血性弧菌感染而患病人数约为10.746人[9]。因此，对于疑似感染副溶血弧菌的腹泻病人的样本正确及时检出显得尤为重要。

采集市售腹泻样本20份，由第三方检测公司按国标检测后，结果为：腹泻样中检测出的菌为大肠O157：H7，不含有沙门菌，单増李斯特菌，副溶血性弧菌等三种实验需检测的菌。按照国标培养副溶血弧菌增菌液，任意取15份腹泻样上清9 mL，加入1 mL菌液，使样本的含菌量达到103～104 cfu/mL，摇匀，分装成三份。剩余5份腹泻样本取上清10 mL，摇匀，分装成三份。制成3组平行样本，每组20份，分发至三个实验室进行检测。

2.3 市场食品样测试阶段

采集市售水产品样本30份，实验前或实验同时，由上海市营养食品质量监督检验站按国标对30件水产品中的副溶血弧菌进行定量测试，以此作为结果比对的金标准。测试结果中有5份阳性，将阳性样本一分为二。取5份阴性样本，按国标培养副溶血弧菌菌液后接种，使样本含菌量达10.000 cfu/mL，将阳性样本一分为二，共计阴性样本10份，国标检测出阳性样本10份，接种阳性样本10份，共30份。将30份样本平分为3份，分发至三个实验室进行检测。

3 结果

3.1 实验室自配阳性样品测试阶段结果

8个阳性样本在6次试验中均被检出，阳性检出率为100%，阴性样本有一次被检出为假阳性，准确率为91.7%（表2）。该方法对100 cfu/mL的菌液仍有很好的检测率，且阳性样本均能在30 min内出现S型扩增曲线出峰。

3.2 腹泻病人生物样本测试阶段结果

5个阴性样品在6次试验中出现了较多假阳性，准确率为50%，可能是由于操作导致底物或阴性样本污染；15个接种菌样的样品在6次试验中仅出现一次假阴性，检出率为98.9%（表3）。

3.3 市场食品样测试阶段结果

实验室3阳性结果检测时间缺失，仅有阴阳性结果。检测结果中阳性品检出与样本阳性一致，检出率为100%；阴性的准确率偏低，假阳性较多，准确率为51.7%（表4）。

4 讨论

实验各阶段灵敏度、特异度分析如表5。

实验室自配样品检测灵敏度、特异度、真阳性率、真阴性率都高，证实了仪器及试剂盒的稳定性与可靠性，仅一例阴性样本在40 min时出现假阳性，可能为操作中的交叉污染导致。

腹泻阳性样本基本都能检出（98.9%），市场样本100%检出，说明该试剂盒稳定性良好，适用范围较广。仅有一例出现假阴性，在试验试剂严格配置正确的情况下应该可以避免此现象发生。然而两者均有较多的假阳性样本，可能在菌液分装过程中导致交叉污染，或是配置检测试剂时导致污染。实验操作应在无菌台上操作，实验室应保持通风良好，避免操作过程中的污染。由于实验室条件限制，以及操作人员的不熟练，导致假阳性检测的产生，在今后应用过程中应予以注意。若剔除30 min后转为阳性的样本，将其归为阴性，则各阶段灵敏度、特异度分析见表6。

可见当剔除30 min后转为阳性的样本后，特异度显著提高，试剂盒规定仪器检测时间为45 min，许多假阳性样本由于污染，样本内菌液浓度不高，均在30 min甚至40 min后才转为阳性，可以考虑将检测时间缩短至30～35 min，会大大降低假阳性发生的可能性。

本研究所使用的陽性样本菌液大多为实验室根据国标配置，与市售污染水产品或实际腹泻病人样品中副溶血弧菌的真实生长繁殖环境及菌液浓度可能存在一定的差异，后期有必要增加实际受污染的样品做进一步的复检。

该恒温扩增荧光PCR检测方法及快速检测试剂盒稳定有效，灵敏度极高，且适用范围广，对腹泻样本及市场食品样本均有良好的检出率，且操作简单，耗费经济，对我国食品中副溶血弧菌检测具有重要意义。实验过程中仍需要谨慎操作，控制适宜的实验条件，尽可能减少假阳性检测的发生，提高特异度，进一步扩大该检测方法的使用范围和接受程度。

参考文献

[1]强世龙，张公亮，孙黎明，等.双重PCR快速检测海水贝类中副溶血性弧菌[J].大连工业大学学报，2015，34（1）：6-10.

[2]杨贵清，杜小莉，卓菲，等.副溶血性弧菌流行特征及毒力基因分析[J].热带医学杂志，2015，15（8）：1026-1030.

[3]JOSEPH S W，COLWELL R R，KAPER J B.Vibrio parahaemolyticus and related halophilic Vibrios[J].Crit Rev Microbiol，1982，10（1）：77-124.

[4]刘秀梅，陈艳，王晓英，等.1992—2001年食源性疾病暴发资料分析——国家食源性疾病监测网[J].卫生研究，2004，33（6）：725-727.

[5]李红娜，袁飞，周伟娥，等.副溶血弧菌检测方法研究进展[J].食品工业科技，2016，37（12）：371-374.

[6]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验：GB 4789.7-2013[S].北京：中国标准出版社，2014.

[7]易敏英，凌莉，刘助红，等.恒温实时荧光法检测副溶血性弧菌[J].现代食品科技，2013，29（5）：1131-1135.

[8]李晶娇，薛峰，曾德新，等.副溶血弧菌毒力因子的研究进展[J].畜牧与兽医，2014，46（12）：116-119.

[9]王李伟，张昭寰，赵勇，等.市售水产品中副溶血性弧菌污染的定量风险评估[J].上海预防医学，2016，28（6）：365-371.

（收稿日期：2017-06-23 ）