LNG-IUS治疗子宫肌瘤的临床效果及机制探讨

徐 青 付子毅 马慧媛 陈 艳 吴晓丽 徐 娟

南京医科大学附属妇产医院(210004)

子宫肌瘤在40～50岁女性群体中发病率超过60%，近年来更呈现年轻化趋势[1]，已成为育龄期妇女行子宫切除术的首要病因[2]。其发生与细胞增殖及细胞凋亡的失衡有关，而许多药物是通过诱导肿瘤细胞凋亡起治疗作用。近年来，随着对子宫肌瘤病因学研究的进展，局部应用孕激素类药物的治疗方法备受关注。左炔诺孕酮宫内缓释系统(LNG-IUS)是当前国际公认性能优良的宫内避孕系统。研究发现，使用LNG-IUS能使子宫肌瘤变小，经量减少，其对子宫肌瘤的治疗作用可能与抑制内膜生长有关。然而LNG-IUS所形成的局部高效孕激素环境，是否还存在其他治疗作用靶点和机制尚不清楚。本院对子宫肌瘤伴月经量多而不愿切除子宫的患者放置LNG-IUS治疗，对缓解月经过多取得了较好疗效，总结分析如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择

选择2011年6月—2012年6月在南京妇产医院门诊就诊，主诉为月经过多，伴不同程度的贫血且不愿手术切除子宫的子宫肌瘤患者36例，年龄(38.7±7.5)岁(26.0～48.0岁)，子宫增大<12周妊娠，子宫肌瘤结节≥1个，最大直径2.5～5.0 cm。术前签署知情同意书，无放置LNG-IUS禁忌证，无生育要求，无反复脱器史，3个月内未使用任何激素。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 人子宫平滑肌瘤细胞获取(UtLMC)

术中获取子宫肌瘤组织，采用消化法及组织块贴壁两种方法[3]分离培养肌瘤细胞。实验均选用第6代以内的瘤细胞。

1.3 试剂

高糖DMEM、胎牛血清、Ⅰ型胶原酶、L-谷氨酰胺(美国Gibco公司)；胰蛋白酶、LNG、PI(美国Sigma公司)；二甲基亚砜、四甲基偶氮唑盐(美国Amresco公司)；活细胞/凋亡细胞/坏死细胞鉴别试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)。

1.4 置器方法

1.4.1 LNG-IUS放置放置前测血常规，B超测量肌瘤体积及子宫容积。于月经后3～5 d刮除大部分内膜后放置LNG-IUS(德国Bayer公司生产)， B超检查放置位置，取子宫内膜行病理检查。

1.4.2随访及观察指标放置LNG-IUS后第1，3，12，48个月随访：①月经量变化，统计月经量并按PBAC法[4]进行评分；②贫血改善情况，观察置器后的血红蛋白水平的变化；③子宫瘤体及容积变化，B超测量肌瘤体积，多发性肌瘤仅测量最大肌瘤体积，B超测量子宫容积；④置器后脱落率及不良反应的发生率，包括点滴出血、月经稀发(闭经)、腰腹疼痛、分泌物增加、激素反应等。

1.5 实验室检测

1.5.1四甲基偶氮唑盐法(MTT) 实验分3组：对照组(培养基添加二甲基亚枫)；加入左炔诺孕酮(LNG)组，LNG终浓度分别为5，10，15，20，25 μg/ml；加入17 -βE2组，E2终浓度分别为366，3660，36 600 pmol/L。MTT法：选取对数生长期UtLMC，调整细胞浓度至0.5×105/ml接种96孔板，每孔200.0μl；实验按对照组和LNG、E2药物浓度梯度组，每组3复孔；在培养终止前4 h，每孔加入5.0 g/L MTT 20 μl，继续培养4 h后，吸除原有培养液，每孔加DMSO 150 μl，振荡溶解紫色甲瓒，波长570 nm在酶标仪上测定吸光度(A)值。实验重复3次，计算LNG、E2各浓度在不同时间段对UtLMC的增殖抑制指数(IR)。IR=[(对照组A值-加药组A值)/对照组A值]×100%。

1.5.2流式细胞术选取对数生长期UtLMC，按0.5×105/ml细胞浓度接种于50.0ml培养瓶内，待细胞生长密度>60.0%，更换含LNG的无血清培养液，药物浓度分别为0，10，15，20，25 μg/ml，流式细胞仪测定凋亡细胞百分率。

1.6 统计学处理

采用SPSS18.0软件进行统计学分析, 计量资料以均数示，统计处理采用单因素方差分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LNG、E2对UtLMC的增殖调节作用

MTT结果表明：①与对照组相比，较低浓度LNG(<10 μg/ml)增强UtLMCs的细胞活力，当LNG浓度达10.0μg/ml后，对UtLMCs出现抑制作用，并随作用时间的延长及药物浓度的增加抑制作用加强，呈现时间及药物浓度依赖性(表1)。②与对照组相比，48 h内，低浓度E2(≤366 pmol/L)抑制UtLMCs的细胞活力，高浓度E2(≥3660 pmol/L)增强UtLMC的增殖活力；但随着E2暴露时间的延长，72 h时≤3660 pmol/L E2抑制UtLMCs的增殖能力，而高浓度E2(≥36 600 pmol/L)显著增强UtLMC的增殖能力(图1)。

表1 不同浓度LNG在各作用时间时人子宫肌瘤细胞增殖抑制作用比较

*与对照组比较P<0.05

图1 E2对人子宫肌瘤细胞的增殖活力影响(MTT法)

2.2 LNG对人子宫肌瘤细胞凋亡的影响

流式细胞分析结果显示，在不同浓度的LNG处理作用下(0，5，10，15，20，25 μg/ml)，细胞凋亡率分别为2.9%，3.8%，9.2%，13.7%，18.8%，23.4%。提示，自LNG 10.0 μg/ml浓度开始，与对照组相比UtLMCs的凋亡率出现差异，且UtLMCs的凋亡率随LNG浓度增加而逐渐升高，具有浓度梯度依赖性(r2=0.9799，P=0.036)(图2)。

2.3 临床指标变化

置器1个月后妇女月经量较放置前明显减少，血红蛋白水平显著提高，子宫容积较放置前缩小(P=0.028)；随置器时间延长临床效果更为明显；放置后子宫肌瘤的大小有缩小的趋势但与放置前比较未见统计学差异(P=0.078)。 见表2。

表2 置器前后临床情况比较

*与置器前比较P<0.05

LNG 浓度(A: 对照组; B: 5μg/ml; C: 10 μg/ml; D: 15 μg/ml; E: 20 μg/ml; F: 25 μg/ml)图2 不同浓度LNG作用后UtLMCs的流式分析图

2.4 副作用情况

放置1个月后随访，1例LNG-IUS脱落，不规则阴道点滴出血副作用发生率最高，随着放置时间的延长逐渐减少，大部分至3～6个月消失。所有痛经患者放置LNG-IUS 3个月痛经全部消失；9例在放置后10个月闭经,5例在放置1年后闭经；1例放置后9个月行子宫肌瘤剔除术，术后继续放置LNG-IUS，未出现复发现象。见表3。

表3 放置LNG-IUS后不同时期副作用发生情况[例(%)]

3 讨论

子宫肌瘤是由子宫的平滑肌细胞演变而来，由单一的肌瘤细胞分裂增殖而成的一种单克隆良性肿瘤[4]。各国学者一直致力于该病病因及其发病机制的研究，目前认为其发生发展可能与遗传、卵巢内分泌功能、雌(孕)激素及肌瘤组织中雌(孕)激素受体、生长因子、细胞凋亡、癌基因与抑癌基因、细胞免疫、表观遗传学等因素有关[5-7]。

子宫平滑肌瘤为卵巢性激素依赖性肿瘤，雌(孕)激素的浓度被认为是其生长的主要决定因素。Brandon等[8]已经揭示了相比于正常的子宫肌层，子宫平滑肌瘤中的雌、孕激素受体的表达有所增加。2015年SOGC子宫肌瘤管理指南中表明天然或合成的孕激素对子宫肌瘤生长可能有双重调节作用[9]。有文献报道，应用LNG-IUS对于子宫平滑肌瘤的治疗有效，会导致子宫内膜萎缩性的变化，使其增殖减少和凋亡增加，每月的月经出血量有明显下降[10-11]。Grigorieva等[12]将LNG-IUS用于子宫平滑肌瘤合并月经过多的前瞻性自身对照研究，结果发现LNG-IUS能使肌瘤变小。这些均提示孕激素可能对子宫肌瘤的生长具有双重调节作用。

本文临床观察36例宫内应用LNG-IUS治疗子宫肌瘤，1例在放置1个月后脱落，考虑与子宫腔过大有关，因此对于肌瘤直径>5.0cm，宫腔>9.0cm 者慎用此方法；置器患者肌瘤的体积未增大，1例在放置LNG-IUS后9个月行子宫肌瘤剔除术，术后继续放置LNG-IUS，未出现复发现象，提示LNG-IUS对子宫肌瘤有抑制其生长及降低其复发的作用，与国外文献结果相同[13]。由于患者是在刮宫去除大部分子宫内膜后放置LNG-IUS，使得LNG对残留的内膜局部作用得以增强[14]，因此可使其置器后出血减少，患者更易接受；8例在放置后10个月闭经，其余均为少量及点滴出血，患者血红蛋白水平明显提高，贫血症状得到改善，子宫容积较置器前缩小，且全身副作用较小。肿瘤生长的稳态调控网络是细胞增殖和细胞死亡动态平衡的结果。LNG-IUS每天向宫腔内释放20 μg LNG，远远高于生理浓度的孕激素水平及肌瘤组织中正常的黄体酮含量[15]，这种局部高浓度LNG是否为孕激素对肌瘤生长的逆向调节作用目前尚不明确。为了寻求答案，本研究采用MTT法检测LNG、E2对UtLMCs的增殖调节作用与药物剂量及作用时间之间的关系，结果表明，浓度为5 μg/ml LNG对UtLMCs的增殖无明显影响，但当浓度增加至10 μg/ml后能明显抑制细胞增殖，随着LNG浓度的进一步增加和作用时间的延长，该增殖抑制作用不断增强，浓度为25 μg/ml时对UtLMCs 的24 h、48 h和72 h抑制率分别达20.48%、 21.10%和24.36%。与对照组相比，不同时点低浓度E2抑制UtLMCs的细胞活力，高浓度E2显著增强UtLMCs的增殖活力。

肿瘤的发生是肿瘤细胞增殖和凋亡失衡的结果。许多药物可通过诱导肿瘤细胞凋亡而起治疗作用。本研究采用流式细胞术检测加入LNG后子宫平滑肌瘤细胞的凋亡率。实验结果发现LNG浓度增至10 μg/ml后，子宫肌瘤细胞的凋亡率显著上升，并随药物浓度增加而增加。

综上所述，LNG-IUS对子宫肌瘤有较好的临床疗效，其治疗作用可能与局部高浓度LNG抑制肌瘤细胞增殖、诱导肌瘤细胞凋亡有关。这也在一定程度上提示，孕激素在子宫肌瘤发生发展的进程中可能扮演着双重角色。鉴于诱导肿瘤细胞凋亡的策略已成为近年来肿瘤治疗的重点，后续仍需大量的研究来明确具体的分子机制。