长期微重力暴露所致眼损伤疾病动物模型的构建*

李向前 任 泽 严伟明 龙 盘 陈 涛,3 张作明

(1. 空军军医大学基础医学院四大队十九连，西安 710032)(2. 空军军医大学航空航天临床医学教研室，西安 710032) (3.空军军医大学卫生勤务学教研室，西安 710032)

人类航天发展史已从短期航天飞行发展到中、长期航天飞行。而中、长期航天飞行所面临的医学问题更加复杂，对航天员也提出了更严峻的挑战。良好的视觉功能是保证宇航员对航天器准确操控的基础，是宇航员高质量完成各项飞行任务的重要保证。因此，微重力对眼部的影响成为国内外航天医学工作者们关注的重要问题之一。但是，由于缺乏稳定可靠的研究资源严重影响了该问题的研究。目前，参加过航天飞行任务的宇航员数量有限，其中具有长期航天飞行经历的宇航员则少之又少。将动物直接置于外太空进行造模，成本过高且不便于实施。同时由于以往小动物眼部检测技术的不足，导致目前尚无一种明确的地面模拟微重力导致眼部损伤疾病动物模型。但是，随着各项中长期载人航天计划的推进，当前急需在地面建立相应疾病动物模型。据此，本研究拟基于经典尾部悬吊模拟失重大鼠模型进行长期微重力暴露所致眼损伤疾病动物模型的探索。

1 材料与方法

1.1 实验动物

正常SD大鼠,24只，(150～180)g/只，购自空军军医大学实验动物中心，实验动物生产许可证：[2014(陕)SCXK-002]。

1.2 方法

1.2.1实验分组及处理：24只大鼠在实验室内适应性饲养1周后，按随机数表法分为两个实验组(M4组和M8组)和两个对照组(N4组和N8组)，每组各6只。

M4组和M8组大鼠尾部悬吊按经典方法进行，单独饲养于特制有机玻璃鼠笼内(如图1)。具体方法包括尾部皮肤表面准备、粘贴固定和悬吊三个步骤。将要悬吊的大鼠置于自制大鼠限动盒中，使其尾部外露。先用肥皂水清洗尾部表面，并用电吹风吹干。再依次向尾部表面喷涂安息香酊和松香酊，并吹干，以防止粘贴物对皮肤的激惹作用。然后，自一侧尾根部起，按纵向走行，将一长约20 cm，与尾部等宽的医用胶布条，粘贴于尾部表面至距尾尖部3～5 cm处，再将胶布条绕过一空心小柱粘贴于对侧的尾部皮肤上，另外两侧皮肤则不粘贴胶布以作为下次更换胶布时的粘贴部位。接着，在此段尾部的表面，再依次间断地轻轻加绕2～3圈0.8 cm宽的胶布条和连续缠绕一层1.5 cm宽的纱布条，以对纵行胶布条进行加强固定。用一绞丁环将有纵行胶布条绕过的空心小柱与悬吊笼上可沿水平吊梁滑动的滑轮相连。绞丁环可使悬吊大鼠作360°的平面旋转活动。调节水平吊梁高度，使大鼠的后爪在伸直时刚好不能触及笼的底层，从而使动物始终保持呈头低位(约-30°)。每7 d更换粘贴部位一次。对照组大鼠在同样的环境中单笼饲养，尾部悬吊方法同实验组，但并不呈-30°头低位。各组大鼠均可自由进食饮水，动物房内温度控制在(23±1)℃，并按照12 h光照与12 h黑暗交替的规律进行照明。在尾部悬吊4周或8周时对相应实验组和对照组大鼠视觉功能和形态进行观察评估，同时称量实验动物体质量及比目鱼肌质量。

图1 尾部悬吊SD大鼠示意图Fig.1 The picture of a tail-suspended SD rat

1.2.2视觉电生理检查：大鼠暗适应12 h，于红光环境下进行视觉电生理检查。操作方法简述如下，大鼠常规麻醉后(3 mL/kg 1%戊巴比妥钠+50 μL 100%速眠新)，托比卡胺散瞳后,将大鼠置于操作台上固定，安放电极。视网膜电图(ERG)电极位置：正极为角膜，负极为脸颊，接地为尾部皮下。视觉诱发电位(VEP)电极位置：正极为大脑枕叶对应皮下，负极为脸颊，接地为尾部皮下。随后按照罗兰电生理操作系统进行操作。

1.2.3小动物眼底照相和光相干断层扫描(OCT)检查：将固定并麻醉好的动物置于升降桌上，使用复方托品酰胺滴眼液常规散瞳，并用盐酸奥布卡因进行表麻，摆好眼位，待瞳孔散大后将医用透明质酸钠涂于待测眼角膜上，与小动物眼底成像系统显微镜镜头接触，调整实验台和镜头焦距并拍照；之后将眼科显微成像系统光源调整聚焦，调整镜头焦点至视网膜，而后对视网膜进行光学相干断层扫描(OCT)。每只实验动物双眼均进行拍照。实验完成后用生理盐水清洗双眼，并用左氧氟沙星滴眼液滴眼预防感染。

1.2.4视网膜切片HE染色:活体实验完成后麻醉处死实验动物，取眼球，处理眼球周围多余组织，将眼球固定于眼球固定液中固定2 h后，在角膜处用注射器扎一小孔，用眼科剪将角膜去除，拨出晶状体，之后再将眼球放回固定液中继续固定24 h。后续步骤同常规组织脱水、蜡块包埋、切片制作及HE染色。

1.3 统计方法

ERG结果分析时选用暗适应3.0反应幅值及OPs反应幅值。VEP结果分析时选用P1波峰时值及幅值。OCT及HE染色结果分析视网膜外核层(ONL)厚度。所有数据采用(均值±标准差)进行描述，检验采用两独立样本t检验，α=0.05。

2 结果

2.1 尾部悬吊对大鼠视觉功能影响

如图2所示，尾部悬吊4周后，大鼠视觉功能(ERG和VEP)与对照组相比无统计学差异。而当尾部悬吊时间达到8周时，大鼠视觉功能出现明显下降，ERG暗适应3.0反应[M8vs. N8：(686.60±86.20) vs. (158.80±23.69)μV,P<0.05]及震荡电位OPs反应幅值[M8vs. N8：(52.36±25.31)vs. (18.64±3.25) μV,P<0.05]明显下降，VEP反应幅值无明显改变[M8vs. N8：(14.86 ±1.65) vs. (13.92±2.25) μV,P> 0.05]，但峰时值明显延长[M8vs. N8：(89.83±4.98) vs. (96.67±4.41) ms,P<0.05](图3)。

图2 尾悬吊4周对大鼠视网膜功能和结构的影响注:A：ERG和VEP的典型波形；B： ERG暗适应3.0反应b波振幅统计结果；C：震荡电位OPs反应振幅统计结果；D： VEP反应P1波振幅统计结果；E：VEP反应P1波峰时值统计结果；N.S.：无统计学意义Fig.2 The effects of 4-weeks tail suspension on rat retinal functionNote:A:The typical ERG and VEP waveform of M4 and N4 groups; B:Statistical results of the amplitude of b wave of dark-adapted3.0 ERG; C: Statistical results of the amplitude of dark-adapted 3.0 oscillatory potentials; D: Statistical results of the amplitudeof P1 wave of VEP; E: Statistical results of the latency of P1 wave of VEP; N.S.: No statistical significance

图3 尾悬吊8周对大鼠视网膜功能和结构的影响注:A：ERG和VEP的典型波形；B： ERG暗适应3.0反应b波振幅统计结果；C：震荡电位OPs反应振幅统计结果；D： VEP反应P1波振幅统计结果,N.S.：无统计学意义；E：VEP反应P1波峰时值统计结果；*P<0.05Fig.3 The effects of 8-weeks tail suspension on rat retinal functionNote:A:The typical ERG and VEP waveform of M8 and N8 groups; B:Statistical results of the amplitude of b wave of dark-adapted 3.0ERG; C: Statistical results of the amplitude of dark-adapted 3.0 oscillatory potentials; D: Statistical results of the amplitude of P1 wave of VEP, N.S.: No statistical significance; E: Statistical results of the latency of P1 wave of VEP; *P<0.05

2.2 尾部悬吊对大鼠视网膜结构影响

如图4所示，尾部悬吊4周后，大鼠视网膜各层厚度与对照组相比无统计学差异。而当尾部悬吊时间达到8周时，OCT结果可看出大鼠视网膜外核层(ONL)较对照组大鼠明显变薄，视网膜切片HE染色结果也证实了这一结果[(35.13±1.02) vs. (20.32±1.92) μm,P<0.05](图5)，表现为视网膜退行性改变。

图4 尾部悬吊4周对大鼠视网膜结构的影响注:N:对照组；M：模型组；ONL:外核层；INL：内核层；GCL:节细胞层；N.S.:无统计学意义Fig.4 The effects of 4-weeks tail suspension on rat retinal structureNote: A:The typical OCT results of M8 and N8 groups; B:The typical HE staining of retinal section of M8 and N8 groups;C: Statistical results of HE staining on the thickness of ONL; N.S.: No statistical significance

图5 尾部悬吊8周对大鼠视网膜结构的影响注:N:对照组；M：模型组；ONL:外核层；INL：内核层；GCL:节细胞层；*P<0.05Fig.5 The effects of 8-weeks tail suspension on rat retinal structureNote:A:The typical OCT results of M8 and N8 groups; B:The typical HE staining of retinal section of M8 and N8 groups;C: Statistical results of HE staining on the thickness of ONL; *P<0.05

2.3 尾部悬吊对大鼠眼底血流影响

当尾部悬吊时间达到8周时，大鼠眼底虽未见明显视乳头水肿、棉絮斑等改变，但均可见脉络膜血管血流增多现象(图6)。

图6 M8组与N8组大鼠典型眼底比较Fig.6 Comparison of typical fundus between M8 and N8 groups

2.4 尾部悬吊对大鼠体质量及比目鱼肌质量影响

为了证实尾部悬吊8周的模拟失重效应，我们对大鼠体质量和比目鱼肌质量进行称量。结果显示：尾部悬吊8周前后大鼠体质量与对照组间并无统计学差异，而模型组比目鱼肌的质量较对照组明显减轻(P<0.05)(图7)。

图7 尾部悬吊8周后大鼠体质量和比目鱼肌质量比较注:A：尾部悬吊前大鼠体质量统计结果；B：尾部悬吊8周后大鼠体质量统计结果；C：尾部悬吊8周后大鼠比目鱼肌质量统计结果。N.S.:无统计学意义；*P<0.05Fig.7 Comparison of the body weight and the soleus muscle weight between M8 and N8 groups.Note:A: Statistical results of body weight before tail suspension; B: Statistical results of body weight after tail suspension;C: Statistical results of soleus weight after tail suspension; N.S.: No statistical significance;*P<0.05

3 讨论

由于短期航天飞行对眼部损伤并不明显，因此早期人们对微重力引起的眼部病变的研究相对较少[1-2]。但是，随着人们在太空中停留时间的延长，航天环境对眼部的损伤问题逐渐突显。近年来，三大载人航天大国(美国、俄罗斯和中国)的研究都已经证实，长期航天飞行环境的暴露将引起航天员眼部损伤。特别是美国学者Mader等[1]对这一现象进行了详细报道，对300名参加过航天飞行任务的航天员进行调查，发现飞行过程视力下降在短期飞行和长期飞行航天员中的发生率分别为29%和60%。同时，Mader等的研究中还对7名在太空飞行6个月的宇航员进行眼部检查，结果显示：7人平均眼压升高，6人近视力减退，6人视网膜神经纤维层增厚，5人有视乳头水肿，5人出现脉络膜皱褶，5人眼轴变短，3人出现棉絮斑，2人视神经鞘膜扩张。但是，关于该损伤的具体机制还不完全清楚[2]，而合适的疾病动物模型是我们认识生命科学客观规律的实验方法和手段[3]。

已有多篇文献[4-6]报道了失重对动物眼部结构和功能影响。这些研究均是将动物直接置于宇宙空间中飞行，使动物真正暴露于微重力等太空环境中，属于最理想的状态。但是，这种实验的成本过高，且需要在空间站中配备从事动物实验研究的专业人员。因此，在地面上建立一种良好的疾病动物模型是现阶段研究长期微重力环境对眼部损伤急需解决的基础问题。

虽然，该病发病机制尚不完全清楚，但是目前的绝大多数理论还是认为失重导致体液头向转移是其始动因素[2]。因此，本研究拟基于模拟失重经典动物模型(尾部悬吊后肢去负荷模型)开展相关工作。并从视网膜功能和形态上证实了尾部悬吊可较好地模拟长期微重力暴露所致眼部损伤效应。而且，摸索出最佳造模时间为尾部悬吊8周。在失重对心血管、骨骼等效应的研究中，尾悬吊时间多为4周。然而，我们的实验结果表明，尾部悬吊4周并不能模拟出长期微重力暴露所致眼部损伤效应，直至尾部悬吊8周时方可较好地对该疾病进行模拟。