益生菌对酸牛奶中酵母霉菌的抑菌效果分析

郑玮丽，刘艳玲，康红艳，李 宠

（河北新希望天香乳业有限公司，河北保定 071000）

0 引言

酵母菌和霉菌是引起酸奶腐败的主要污染微生物[1-2]，容易导致酸奶生产污染或产品腐败。乳杆菌和链球菌发酵期间的代谢产物有抑制酵母菌和霉菌生长的作用[3]，试验以具有抑制青霉菌能力的优势菌株——植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌作为发酵菌株，对单一菌种或复配菌种进行培养，以抑菌圈和发酵乳酸度为检测指标，挑选具有明显抑菌作用的菌株培养方式，以期减少因污染而造成酸乳的腐败变质。

1 材料和方法

1.1 设备

牛津杯（内径6.0 mm，外径7.8 mm，高9.7 mm）；LRH-250A型生化培养箱，广东医疗器械厂产品；SPX-250型生化培养箱，上海跃进医疗器械厂产品；CTR16-2型离心机，北京时代北利离心机有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 益生菌上清液的制备

选用单一菌种或复配菌种进行培养，菌种分别为1号植物乳杆菌、2号副干酪乳杆菌、3号嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌。将菌种在无菌操作台中接种于灭菌的MRS肉汤培养基，于36℃条件下培养48 h。将培养后的菌液于沸水中灭活15 min，以转速8 000 r/min离心15 min，取上清液在于4℃条件下冷藏备用。

1.2.2 指示菌的分离

从酸牛奶坏包中分离酵母菌和霉菌，挑取单菌落接种于孟加拉红培斜面培养基中，于27℃条件下培养48 h，作为指示菌种。

1.2.3 抑菌试验

从指示菌斜面挑取菌落，用0.9%生理盐水进行梯度稀释。取0.4 mL指示菌悬液均匀涂布在孟加拉红培养基平皿中。在涂布指示菌菌悬液的培养基中呈品字型放置3个灭菌的牛津杯。将牛津杯中加入0.25 mL益生菌上清液溶液（同时做生理盐水对照）。将加入益生菌菌悬液的平皿置于 3～4℃冰箱中静置24 h扩散处理后，放置在26℃生化培养箱中培养2～3 d，观察指示菌的生长情况，拍照记录抑菌圈大小。

1.2.4 后产酸试验

在无菌条件下称量菌种接至灭菌并降温至42℃的牛奶中，在42℃生化培养箱中培养至发酵终点，并在指定条件下贮藏。国标法测定发酵终止酸度及不同条件下贮藏产品的酸度[4]。

2 结果与分析

2.1 指示菌浓度的确定

用生理盐水对分离的酵母菌和霉菌进行梯度稀释，对酵母菌进行 1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5梯度稀释；对霉菌进行1×10-1，1×10-2，1×10-3梯度稀释，涂布于孟加拉红平皿中，于26℃生化培养箱中培养。经过2～3 d后观察，酵母菌1×10-4，霉菌1×10-1浓度涂布后菌落密度适宜，菌落均匀分布于平皿中，选择酵母菌1×10-4稀释度、霉菌1×10-1稀释度进行抑菌试验。

2.2 对酵母菌的抑制试验结果

益生菌上清液对酵母菌的抑制效果见表1。

表1 益生菌上清液对酵母菌的抑制效果

通过试验发现，1号植物乳杆菌、2号副干酪乳杆菌牛津杯周围无抑菌圈形成，牛津杯内几乎没有或仅有少量菌落形成；3号嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌牛津杯中及周围均有酵母菌生长，没有抑菌圈形成，4号生理盐水没有抑菌效果。试验结果表明，1号植物乳杆菌和2号副干酪乳杆菌对酵母菌有抑制效果，3号嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌和4号生理盐水相比无差异，没有抑菌效果。

2.3 对霉菌的抑制试验结果

益生菌上清液对霉菌的抑制效果见表2。

表2 益生菌上清液对霉菌的抑制效果

试验结果表明，1号植物乳杆菌、2号副干酪乳杆菌牛津杯有明显的抑菌效果，在牛津杯周围形成明显的抑菌圈，1号植物乳杆菌的抑菌圈直径大于2号副干酪乳杆菌的抑菌圈直径；3号嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌牛津杯中及周围均有菌生长，没有抑菌圈形成；4号生理盐水没有抑菌效果，牛津杯内外均长满霉菌。结果表明，植物乳杆菌和副干酪乳杆菌对霉菌均有明显的抑制效果，且植物乳杆菌的抑制效果更强，3号嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌和4号生理盐水相比无差异，没有抑菌效果。

2.4 益生菌对后产酸的影响

益生菌对后产酸的影响见表3。

表3 益生菌对后产酸的影响

将1号用菌种BF-201，2号BF-201与植物乳杆菌1∶1混合（均按推荐添加量的50%添加） 3号BF-201与副干酪乳杆菌1∶1混合（均按推荐添加量的50%添加） 进行发酵试验，发酵温度42℃，发酵时间5.5 h，发酵后样品置于4℃冰箱中冷藏，分别于2，4 d后测定酸度，对应批次样品常温放置、等时检测酸度作为对照。酸度变化表明植物乳杆菌作为菌种添加后酸度变化缓慢，有助于延缓酸奶腐败。

3 结论

通过牛津杯法评价益生菌上清液对发酵乳产品中酵母菌、霉菌的抑菌效果分析可知，植物乳杆菌和副干酪乳杆菌对发酵乳坏包分离的酵母和霉菌有抑菌效果，且抑制效果与指示菌种类有关，对霉菌有显著的抑制效果，对酵母菌的抑制效果较弱。添加植物乳杆菌或副干酪乳杆菌对后产酸基本无影响，可以将植物乳杆菌和副干酪乳杆菌添加到发酵乳中用于控制杂菌特别是酵母菌、霉菌滋生，降低产品坏包率，延长产品货架期。