绿薄荷精油对温和气单胞菌群体感应现象及其腐败特性的抑制作用

梅永超，李婷婷*，刘 楠，王当丰，赫彬彬，励建荣,*

（1.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州 121013；2.大连民族大学生命科学学院，辽宁 大连 116600）

群体感应（quorum sensing，QS）是细菌细胞间交流的一种通讯机制，具有QS机制的细菌通过感知环境中低分子质量、可扩散的信号分子来调控菌体密度，并在信号分子达到阈值时启动相关基因表达，从而调控细菌的生理行为，以适应环境的变化[1-2]。研究表明，细菌的相关腐败特性，如生物被膜的形成、胞外蛋白酶、嗜铁素的产生等均依赖于QS系统的调控[3]。温和气单胞菌是鱼类等水产品低温贮藏过程中常见的腐败菌之一，且能够产生N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）来调控其生物特性的表达[4-5]，以QS信号分子为靶点来阻断QS系统已成为水产品防腐保鲜的一种新策略。阻断或干扰细菌QS机制，主要有以下3 种途径[6-7]：抑制信号分子的合成，如利用三氯生抑制合成AHLs前体物质的酶活力；降解信号分子活性，如利用内酯酶水解AHLs的内酯环，或利用酰基转移酶水解AHLs的酰氨键；干扰信号分子与受体蛋白的结合，如合成信号分子结构类似物与信号分子受体蛋白竞争性结合。其中，QS抑制剂（QS inhibitors，QSIs）是指那些可以阻断细菌种内或种间信息交流，对细菌QS现象具有抑制或干扰作用的物质。目前，已发现的QSIs多存在安全性问题，且难以在实际生产中应用。

天然植物精油提取工艺成熟、原料来源广泛，且具有安全、无毒的优点。从天然植物精油中寻找QS抑制剂日益受到人们的关注[8-9]。如Myszka等[10]发现百里香精油可有效抑制荧光假单胞菌KM121 QS现象及其生物被膜的形成。绿薄荷，亦称留兰香，为唇形科（Labiatae）薄荷属（Mentha）直立多年生芳香草本植物，是世界上主要的香料植物之一，原产于南欧，在我国一些省份大面积种植[11]。绿薄荷精油是将其新鲜茎、叶等地上植株经水蒸气蒸馏而得的一种天然的、淡黄或黄绿色澄清的油状液体。其化学成分较为复杂，主要成分包括香芹酮、柠檬烯、蒎烯、月桂烯、桉叶油素、3-辛醇、薄荷酮等[12]。绿薄荷精油在日化、食品和医药领域应用广泛[13]。在食品工业中，它是一种重要的调味香料和食品添加剂，常用于糖果（口香糖）、烟酒、冰淇淋等产品。此外，有研究表明，绿薄荷精油具有良好的抗菌、抗氧化作用[14]，可用作天然食品防腐保鲜剂，在果蔬[15]、牛奶[16]中已有报道。但目前绿薄荷精油作为QS抑制剂的研究却鲜有报道。

本研究以绿薄荷精油为研究对象，探讨绿薄荷精油对温和气单胞菌QS及其腐败特性的抑制效果，为绿薄荷精油更广泛的利用提供理论参考，同时也对丰富和创新水产品贮藏保鲜理论、提高水产品品质具有参考意义。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

紫色杆菌Chromobacterium violaceum 026（CV026）为C. violaceum ATCC 31532的mini-Tn5突变体，卡那霉素抗性，仅当存在外源AHLs时，菌株CV026产生特征性紫色色素。供试菌温和气单胞菌（Aeromonas sobria），从腐败大菱鲆中分离、鉴定。两种菌株均为生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心保藏，在28 ℃、160 r/min条件下摇床培养。

绿薄荷精油（含50%～70%香芹酮） 长沙冠香日化贸易有限公司；卡那霉素、冰醋酸国药集团化学试剂有限公司；信号分子标准品（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL） 美国Sigma公司；甲醇、十二烷基硫酸钠、正丁醇、醋酸异戊酯、乙酸乙酯 天津风船化学试剂有限公司；蛋白胨 北京奥博星生物技术有限责任公司；结晶紫 天津致远化学试剂有限公司；载玻片 江苏飞舟玻塑有限公司；锌片 上海迈砷化工有限公司；LB肉汤（胰蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、氯化钠10.0 g/L，pH（7.0±0.1））、LB营养琼脂（胰蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、氯化钠10.0 g/L、琼脂15.0 g/L，pH（7.0±0.2）） 青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Biofuge Stratos冷冻高速离心机 美国Thermo公司；imark酶标仪 美国Bio-Rad公司；80i显微镜 日本尼康公司；SS-4800场发射扫描电子显微镜 日本日立公司；7890N/5975气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）联用仪 美国Agilent公司；W-CJ-2FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；LRH系列生化培养箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抑菌活性及QSIs检测

最小抑菌浓度实验：菌株CV026与温和气单胞菌过夜活化两次后，按2%接入量接种于新鲜LB肉汤中（培养菌株CV026的LB肉汤中需含有20 μg/mL卡那霉素），160 r/min振荡培养16～18 h，与100 mL LB营养琼脂培养基混合，倒平板，待凝固后用牛津杯打孔，将200 μL不同剂量的绿薄荷精油（2、4、6、8 μL/mL和10 μL/mL）加到孔中。将平板置于28 ℃条件下培养1～2 d，观察菌株的产生情况。以体积分数50%甲醇溶液作为阴性对照。

QSIs检测实验：菌株CV026过夜活化两次后，按2%接入量接种于含有20 μg/mL卡那霉素的新鲜LB肉汤中，160 r/min振荡培养16～18 h，与100 mL含有20 μg/mL C6-HSL（信号分子）LB营养琼脂培养基混合，倒平板，待凝固后用牛津杯打孔，将200 μL不同剂量的绿薄荷精油（0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL）加到孔中。将平板置于28 ℃条件下培养1～2 d，观察紫色菌素的产生情况。以体积分数50%甲醇溶液作为阴性对照。

1.3.2 紫色菌素产量的测定

根据参考文献[17]，菌株CV026过夜活化后，按1∶100（V/V）接种于含有不同剂量绿薄荷精油（0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL）的LB肉汤中，并加入20 μg/mL C6-HSL，160 r/min、28 ℃振荡培养48 h。同时设立不加信号分子的实验组，以测定绿薄荷精油对菌株CV026生长情况的影响。

依次吸取300 μL添加信号分子实验组的培养液于1.5 mL离心管中，加入150 μL 10%十二烷基硫酸钠，振荡10 s，加入600 μL正丁醇，振荡5 s，10 000 r/min离心5 min，吸取200 μL紫色上清液添加到96 孔板中，用酶标仪测定OD595nm，以体积分数50%甲醇溶液为阴性对照。

1.3.3 绿薄荷精油对温和气单胞菌生物被膜形成的影响

1.3.3.1 酶标板法测定生物被膜

参考文献[18]，将过夜活化的温和气单胞菌分别与新鲜LB培养液按1∶100（V/V）混匀后，取1 mL分装至无菌的离心管中，加入终剂量为0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL的绿薄荷精油，以加入等体积的体积分数50%甲醇溶液为阴性对照，等体积20 μg/mL C6-HSL为阳性对照，28 ℃静置培养48 h，测定其菌液密度后，弃去培养液，用无菌水清洗3 次，无菌风干燥固定35 min，随后加入1 mL 0.1 g/100 mL的结晶紫染色15 min（室温下），用无菌水清洗干净，溶解于体积分数33%冰醋酸溶液中，用酶标仪测定OD595nm。生物被膜相对生成率按公式（1）计算。

式中：OD595nm实验组为某一实验组测得的生物被膜的OD595nm；OD595nm阴性对照组为阴性对照组测得的生物被膜的OD595nm。

1.3.3.2 光学显微镜及扫描电子显微镜观察生物被膜

载玻片（普通载玻片，25.4 mm×76.2 mm，厚度1～2 mm）预处理：置于体积分数2%盐酸溶液中浸泡24 h后，用蒸馏水洗净、烘干，灭菌备用。

锌片（纯度≥99.0%，厚度0.20 mm）预处理：将锌片用抛光机打磨去除表面氧化层后，切割成10 mm×10 mm大小，然后放入无水乙醇中超声15 min，再放入去离子水中超声15 min，然后烘干，灭菌备用。

在无菌培养皿中加入10 mL含有1%温和气单胞菌菌液的LB肉汤，并分别加入终剂量为0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL的绿薄荷精油，混合均匀后放入处理后的载玻片或锌片，28 ℃静置培养72 h。同时，设立不添加绿薄荷精油的阴性对照组和添加C6-HSL信号分子的阳性对照组。

光学显微镜观察：72 h后取出载玻片，无菌水冲洗，除去浮游菌及黏液，置于无菌培养皿中，加入适量甲醇固定15 min，再加入适量2%结晶紫溶液染色5 min后，用无菌水冲洗干净，25 ℃下进行干燥，干燥后在光学显微镜下观察，拍照记录。

扫描电子显微镜观察：72 h后取出锌片，用无菌水反复冲洗3～5 次，将锌片放入4 ℃预冷的体积分数2.5%戊二醛溶液中浸泡4 h，取出后，梯度体积分数乙醇脱水，再经醋酸异戊酯置换两次，自然干燥后喷金处理，用扫描电子显微镜观察。

1.3.4 绿薄荷精油对温和气单胞菌胞外蛋白酶活力的影响

根据文献[19]，制作牛奶琼脂平板，用牛津杯打孔，加入含有不同剂量（0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL）绿薄荷精油过夜培养的温和气单胞菌菌液，28 ℃静置培养18～24 h。蛋白酶水解酪蛋白后，在孔周围出现明显的水解圈，水解圈越大，胞外蛋白酶活力越高。以不加绿薄荷精油的菌液为阴性对照，以添加C6-HSL信号分子为阳性对照。每个处理3 个平行，用游标卡尺测量其直径。

1.3.5 绿薄荷精油对温和气单胞菌群集和泳动的影响

参考文献[20]，将绿薄荷精油经0.22 μm的滤膜过滤除菌后，与冷却至40 ℃群集的琼脂培养基（1%蛋白胨（质量分数计，下同）、0.5%氯化钠、0.5%琼脂和0.5%葡萄糖）和泳动的琼脂培养基（1%胰蛋白胨、0.5%氯化钠、0.3%琼脂）混匀，倒平板，使平板中绿薄荷精油的终剂量为0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL，向冷却的平板中央加入5 μL过夜活化两次的温和气单胞菌菌液，无菌风吹干，28 ℃恒温培养48 h，观察测试菌的迁移情况。以不加绿薄荷精油的菌液为阴性对照，以添加C6-HSL信号分子为阳性对照。每个处理3 个平行。

1.3.6 GC-MS定量分析绿薄荷精油对温和气单胞菌产AHLs的影响

AHLs粗提液的制备：将活化好的温和气单胞菌接种于含有200 mL LB肉汤的锥形瓶中，分别摇床培养（28 ℃、160 r/min）12、24、36 h和48 h，10 000 r/min离心10 min，取上清液，用等体积酸化乙酸乙酯（含体积分数0.1%冰乙酸溶液）提取两次，旋转蒸发蒸干有机溶剂（35 ℃，真空度0.1 MPa），用1 mL甲醇溶解残留物，-20 ℃保存备用。绿薄荷精油处理组LB肉汤中需含有2 mg/mL的绿薄荷精油，其余操作同上。

定量方法：AHLs粗提液采用内标法进行GC-MS检测。选择与AHLs具有相似结构（内酯环）且待测粗提取液中不能检出的AHLs标准品作为内标物。经前期研究[21]发现，温和气单胞菌不分泌C14-HSL，因此统一添加2 μL 2 mg/mL的C14-HSL标准品溶液作为内标物到各组粗提取液（1 mL）中，在离子检测（m/z 143）模式下对粗提取液中的AHLs进行定量研究，计算公式如式（2）所示。

式中：C1为样品中Cn-HSL的质量浓度/（μg/mL）；S1为样品中Cn-HSL对应的峰面积。

制作含有6 种AHLs标准品（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL）的混合标准品溶液（溶剂为甲醇，质量浓度200 μg/mL），GC-MS检测，确定各类型标准品的保留时间。

GC-MS条件：色谱柱为HP-5MS石英毛细管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；载气为高纯度氦气，流速为l mL/min；进样口温度250 ℃；传输线温度为280 ℃；升温程序：初温150 ℃，以10 ℃/min升温至220 ℃，保持7 min；接着以5 ℃/min升至250 ℃，保持6 min；最终以0.5 ℃/min升温至252.5 ℃，保持5 min。进样量1 μL，溶剂延迟3 min，分流进样，分流比50∶1，运行总时间18 min。电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃。选择离子检测（m/z 143）模式。

2 结果与分析

2.1 抑菌效果及QSIs活性

图 1 绿薄荷精油对紫色杆菌CV026产紫色素的抑制活性Fig. 1 Inhibitory activity of spearmint oil on violacein production of CV026

通过观察实验菌株的生长情况，发现绿薄荷精油剂量为2、4、6、8、10 μL/mL时，对菌株CV026的最小抑菌剂量为4 μL/mL。随后对温和气单胞菌进行抑菌实验，发现在相同剂量范围内，绿薄荷精油对温和气单胞菌并无抑菌作用。因此选取亚抑菌剂量（4 μL/mL以下剂量）的绿薄荷精油进行QSIs检测实验，并设置实验剂量为0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL。图1表示在亚抑菌剂量下，绿薄荷精油对紫色杆菌CV026 QS活性的影响。从图中可以看出添加绿薄荷精油的孔径周围出现白色、浑浊、不透明的抑制圈，表明绿薄荷精油具有抑制菌株CV026产生特征性紫色素的能力。

2.2 紫色菌素定量分析

通过酶标法测定菌株CV026紫色菌素产量，其相对下降量可反映绿薄荷精油对菌株CV026 QS现象的抑制程度。如图2所示，随着绿薄荷精油剂量的升高，菌株CV026紫色菌素产量呈剂量依赖性下降。与未添加精油相比，当绿薄荷精油剂量为2.0 μL/mL时，菌株CV026紫色菌素产量的下降率达56.17%。同时，研究不同剂量下绿薄荷精油对菌株CV026生长的影响，结果表明，绿薄荷精油并未对菌株CV026菌液密度造成影响，进而说明其并未抑制菌株CV026的生长代谢，而是通过干扰菌株CV026的QS系统，使其紫色菌素的产生受到了抑制。

图 2 不同剂量绿薄荷精油对紫色杆菌CV026紫色菌素产生和菌液密度的影响Fig. 2 Effect of spearmint oil on violacein production of CV026

2.3 绿薄荷精油对温和气单胞菌生物被膜形成的影响

2.3.1 酶标板法测定生物被膜

生物被膜指微生物为适应生存环境而附着于生物或非生物物质接触表面，利用多糖基质将自身包裹而形成的一种聚集体膜样物。生物被膜广泛存在于由金属、塑料、玻璃等各类材料制成的食品机械设备表面，难以彻底清除，且极易导致食品微生物污染，从而造成严重的食品安全问题和经济损失[22]。Aswathanarayan等[23]研究表明，微生物生物被膜的形成受QS系统调控。因此，本研究通过干扰QS系统为靶点来控制生物被膜的形成。从图3可以看出，以空白组为基准（生物被膜相对生成率100%），添加C6-HSL信号分子的阳性对照组生物被膜相对生成率明显增高，进一步说明温和气单胞菌生物被膜生成受QS系统的调控。此外，随着绿薄荷精油剂量的增大，该菌株生物被膜生成率随之减小，而菌液密度未受影响。这说明，绿薄荷精油可通过干扰、抑制QS系统来调控温和气单胞菌生物被膜的生成，且未对菌株有致死或抑制作用。

图 3 不同剂量绿薄荷精油对温和气单胞菌生物被膜生成率的影响Fig. 3 Effect of spearmint oil on biofilm formation of Aeromonas sobria

2.3.2 光学显微镜及扫描电子显微镜观察生物被膜

图 4 绿薄荷精油对温和气单胞菌生物被膜影响的光学显微镜图Fig. 4 Optical micrographs of Aeromonas sobria biofilm

由图4a、b可见，经染色的菌体紧密相连形成大片的紫色膜状物，且添加C6-HSL信号分子的阳性对照组，还出现局部菌体聚集成具有层次感的深紫色团状物；对比绿薄荷精油处理组（图4c～f），经结晶紫染色后，随着添加剂量的升高，菌体难以在载体上牢固附着、易被冲散，未见菌体聚集形成大片紫色膜状物，仅有少量菌体相连且膜状物分布稀疏。

利用扫描电子显微镜可清晰直观地观察生物被膜微观结构的变化。

图 5 绿薄荷精油对温和气单胞菌生物被膜影响的扫描电子显微镜图Fig. 5 Scanning electron microscopic images of Aeromonas sobria biofilm

如图5a、b所示，菌体被胞外聚合物层层包裹形成复杂的三维立体网络结构，并覆盖整个载体表面，单一菌体难以显现。添加C6-HSL信号分子的阳性对照组，生物被膜形态更为致密。

图5c～f为绿薄荷精油处理组，随着绿薄荷精油剂量的升高，网络结构退化并逐渐解体，胞外聚合物明显减少且仅有少量菌体被包裹其中。据此，推测绿薄荷精油可通过抑制胞外聚合物形成，来减弱温和气单胞菌的成膜能力。

2.4 绿薄荷精油对温和气单胞菌胞外蛋白酶活力的影响

温和气单胞菌是鱼类等水产品中常见的腐败菌，具有分泌蛋白水解酶的能力。其致腐机理是利用蛋白酶水解水产品中蛋白质及游离氨基酸，促进自身生长繁殖，从而加速腐败进程，导致水产品风味和品质劣变，甚至产生有毒有害物质[24]。葛静慧等[25]发现降解海参优势腐败菌消化嗜冷杆菌（Psychro-bacter alimentarius）的AHLs可阻断其蛋白酶的产生。赵丽珺等[26]研究发现冷却猪肉中常见的产蛋白酶的腐败菌（假单胞菌和沙雷氏菌）均受AHLs介导的QS系统调控。

图 6 绿薄荷精油对温和气单胞菌胞外蛋白酶活力的影响Fig. 6 Effect of spearmint oil on protease activity of Aeromonas sobria

如图6所示，当外源C6-HSL信号分子存在时，蛋白酶水解圈显著增大。添加绿薄荷精油使蛋白酶水解圈直径明显减小，且水解圈直径与绿薄荷精油剂量呈负相关。这表明温和气单胞菌胞外蛋白酶活力受QS系统调控，且绿薄荷精油可通过干扰QS系统，调控温和气单胞菌胞外蛋白酶的产生。

2.5 绿薄荷精油对温和气单胞菌群集和泳动的影响

群集和泳动是细菌在接触表面迁移的两种方式，群集运动特指发生在大于0.45%的琼脂上的表面迁移，而泳动则指发生在小于0.45%的琼脂培养基上的迁移[27]。细菌的运动性被证实在定植到宿主表面及后继形成生物被膜的过程中发挥着关键作用[28]。Merritt等[29]认为耶尔森鼠疫杆菌的泳动和群集运动受通过QS系统调控的生物表面活性剂的影响。Daniels等[30]还发现QS系统可通过调节群集细胞的分化、鞭毛基因的合成及细菌表面活性物质的产生而参与到不同种类细菌的群集运动。

图 7 绿薄荷精油对温和气单胞菌群集、泳动运动的影响Fig. 7 Effect of spearmint oil on swarming and swimming motility of Aeromonas sobria

图 8 绿薄荷精油对温和气单胞菌运动区直径的影响Fig. 8 Effect of spearmint oil on diameter of the motility zone of Aeromonas sobria

从图7、8中可以看出，添加C6-HSL信号分子的阳性对照组较空白组菌株的运动性明显增强。绿薄荷精油的添加与温和气单胞菌群集和泳动运动特性呈负相关，且有一定的剂量依赖性。这与Merritt[29]和Daniels[30]等的研究结果相一致，且与2.3节中绿薄荷精油对生物被膜的抑制作用呈现一致性。

2.6 GC-MS定量分析绿薄荷精油对温和气单胞菌产AHLs的影响

图 9 AHLs混合标准品GC谱图Fig. 9 GC of mixed AHLs standards

从图9可以看出，各峰分离良好，峰形尖锐呈对称状，C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL在设定时间内完全分离，保留时间分别为4.408、6.254、8.305、10.685、13.374、16.882 min。

由表1可以看出，0～12 h，温和气单胞菌分泌AHLs主要是C8-HSL和C12-HSL，24～48 h为C4-HSL和C8-HSL；在整个实验周期内，C8-HSL的分泌量一直较高。在菌株生长初期（0～12 h）菌株分泌的信号分子不仅种类少且质量浓度很低；随着菌株的生长（12 h以后），信号分子的种类逐渐增加，质量浓度也急剧上升，同时长链的信号分子C12-HSL不再出现，其原因可能是随着菌株的生长和培养基内的营养物质不断消耗，pH值升高导致菌株生长环境发生改变，从而导致长链的信号分子内酯环断裂。与空白组对比，经绿薄荷精油处理的实验组信号分子的种类未发生变化，但其质量浓度明显下降，说明绿薄荷精油能够抑制温和气单胞菌QS信号分子的分泌。

3 结 论

本研究利用紫色杆菌CV026作为QS现象检测对象，验证了绿薄荷精油在亚抑菌剂量下对细菌QS系统的抑制作用。结果表明，绿薄荷精油具有降低菌株CV026产紫色菌素的能力，其剂量为2 μL/mL时，对紫色菌素的抑制率达56.17%；温和气单胞菌某些与腐败相关的生物特性（生物被膜、胞外蛋白酶活力、泳动和群集运动）均受

到QS系统的调控，添加一定剂量的绿薄荷精油能够达到抑制这些生物特性表达的目的，且随着剂量的增加，其抑制效果更趋明显。此外，GC-MS检测结果表明，绿薄荷精油能够有效抑制温和气单胞菌分泌AHLs。因此，绿薄荷精油具有良好的QS抑制活性，可作为新型的QS抑制剂用于水产品防腐保鲜。但是，目前绿薄荷精油对QS系统信号分子分泌、受体蛋白的结合以及相关调控基因表达的抑制机理还未明晰，需要进一步研究。