不同分子质量葡聚糖对玉米醇溶蛋白糖基化产物结构和功能性的影响

赵城彬，张 浩，许秀颖，郑明珠，曹 勇，修 琳，蔡 丹，刘景圣*

玉米醇溶蛋白（Zein）属于醇溶谷蛋白类，主要通过溶剂提取法从玉米加工副产物玉米黄粉中获得，是一种有价值的食品原料，具有环保、可生物降解、无毒、可食用、用途广等优点[1]。Zein具有较高比例的非极性氨基酸残基，占总氨基酸含量的50%以上，使其具有较高的疏水性[2]，导致其不溶于水而溶于乙醇溶液中，限制了其功能性质的发挥。近年来蛋白质糖基化改性受到国内外学者的广泛关注，采用糖基化反应制备改性蛋白应用于食品配方中是一种最具潜力的方法。蛋白质的糖基化是依据美拉德反应原理，由蛋白质的非质子化氨基与糖分子的还原羰基之间发生缩合反应形成席夫碱，然后生成糖基胺重排产物[3]。蛋白质与多糖通过糖基化反应形成复合物能够提高蛋白质的乳化性、热稳定性、抗菌活性和许多其他功能性质[4]。此外，研究表明糖基化反应能够大幅降低蛋白质的致敏性，这与致敏蛋白的结构改变有关[5]。由于该反应不需要催化剂，并在可控的条件下获得所需的反应产物，可以作为新功能性材料应用于食品工业、生物材料及医药科学等领域[6]。目前，有许多关于糖基化反应提高蛋白质功能性质的研究，主要集中在卵清蛋白、溶解酵素、大豆蛋白和乳清蛋白与葡聚糖（dextran，DX）、壳聚糖和半乳甘露聚糖的复合。然而，关于Zein与不同分子质量DX的糖基化产物结构和功能性的研究鲜有报道。本实验采用湿热法制备Zein-DX糖基化产物，对其溶解度、表面疏水性和乳化性进行测定，同时采用傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）技术对蛋白质的分子结构进行分析，探讨不同分子质量DX对Zein糖基化产物结构和功能性的影响，为改善玉米蛋白功能性质和促进玉米精深加工技术提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Zein 百灵威科技有限公司；DX（分子质量为6、20、40、70 kDa） 美国Sigma公司；Lowry法蛋白质含量测定试剂盒 上海荔达生物科技有限公司；邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、β-巯基乙醇、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid，ANS）美国Sigma公司；其他化学试剂均为国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

pHS-3C型酸度计 上海精密科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅 天津天泰仪器有限公司；高速离心机上海安亭科学仪器厂；Alpha1-4LDplus冷冻干燥机 德国Christ公司；1600PC紫外-可见分光光度计 上海美普达仪器有限公司；F-4500荧光分光光度计 日本Hitachi公司；VERTEX 70 FTIR仪 德国Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 Zein-DX糖基化产物的制备

根据Yin Baoru等[7]的制备方法，将Zein分散到KCl-NaOH缓冲液（0.2 mol/L，pH 12.0）中，常温下磁力搅拌1 h使蛋白质充分溶解，配成1 g/100 mL的Zein溶液。以蛋白与多糖质量比为2∶1的比例添加6、20、40、70 kDa的DX，磁力搅拌均匀得到混合溶液，然后在85 ℃水浴中热处理2 h，冰浴冷却至室温，离心分离取上清液，调节pH 7.0，4 ℃透析24 h，冷冻干燥即得Zein-DX糖基化产物，分别用Zein-DX6、Zein-DX20、Zein-DX40、Zein-DX70表示。不含DX的天然Zein为对照组。

1.3.2 接枝度的测定

采用OPA试剂法测定接枝度。将80 mg的OPA溶解在2 mL体积分数95%的乙醇溶液中，并与50 mL 10 mmol/L的四硼酸钠缓冲液（pH 9.7）、5 mL 20 g/100 mL的SDS以及200 μL的β-巯基乙醇混合，充分混匀后用蒸馏水稀释至100 mL配成OPA试剂。将200 μL的蛋白样品溶液（2 mg/mL）与4 mL的OPA试剂在室温体积下反应5 min，然后采用紫外-可见分光光度计测定340 nm波长处的吸光度，以天然Zein作为对照，接枝度的计算公式如下：

式中：DG为接枝度/%；Ac为对照样的吸光度；As为样品的吸光度。

1.3.3 褐变强度的测定

采用0.1 g/100 mL的SDS溶液将样品溶液稀释至蛋白质量浓度为0.2 g/100 mL，空白样为SDS溶液，在420 nm波长处测定吸光度A420nm，以A420nm表示褐变强度。

1.3.4 溶解度的测定

将样品配成蛋白质量浓度为1 g/100 mL的溶液，室温磁力搅拌1 h，采用0.1 mol/L的HCl溶液和0.1 mol/L的NaOH溶液调节pH值分别为2、4、6、8、10、12，然后在12 000×g离心30 min。采用Lowry法测定上清液中蛋白质含量，以牛血清白蛋白为标准物制作标准曲线。蛋白质的溶解度以上清液中蛋白质量占样品中总蛋白质量的百分比表示。

1.3.5 表面疏水性的测定

采用ANS荧光探针法测定蛋白质表面疏水性。将蛋白样品溶于pH 7.0、0.01 mol/L的磷酸缓冲液中，配成质量浓度为0.05～1 mg/mL的蛋白溶液，采用相同的缓冲液配制8 mmol/L的ANS溶液。将40 μL的ANS溶液添加到4 mL的蛋白溶液中，充分振荡混匀后测定荧光强度。激发波长为390 nm，发射波长为470 nm，夹缝宽均为5 nm。以荧光强度对蛋白浓度作图，曲线的初始斜率即为蛋白质的表面疏水性（h0）。

1.3.6 乳化性的测定

根据Molina等[8]的浊度法对乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化稳定性（emulsifying stability index，ESI）进行测定。将蛋白样品溶于0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.5）中，配成蛋白质量浓度为5 mg/mL的溶液，取15 mL的蛋白溶液与5 mL的大豆油混合，采用高速均质机在12 000 r/min均质乳化1 min，分别在第0、30分钟时，从测试管底部取50 µL样品，用0.1 g/100 mL的SDS溶液稀释100 倍，采用Spectra Max 190酶标仪在500 nm波长处测定样品的吸光度，以SDS溶液作为空白。EAI和ESI的计算公式如下：

式中：A0和A30分别为第0、30分钟时的吸光度；DF为稀释倍数（100）；C为蛋白质质量浓度/（g/mL）；φ为乳状液中油相所占比例（0.25）。

1.3.7 FTIR的测定

参照Zhang Xuan等[9]的方法测定FTIR，将蛋白样品与溴化钾研磨成均匀粉末，压片后置于FTIR仪中进行测定。FTIR仪的测定温度为25 ℃，波数扫描范围为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1，波数精度为0.01 cm-1，扫描次数为64 次。利用PeakFit Version 4.12软件对酰胺I带（1 600～1 700 cm-1）谱图进行拟合处理，根据其拟合后的子峰面积计算各二级结构含量。

1.4 统计分析

每组实验重复3 次，采用SPSS V17.0软件进行ANOVA差异显著性分析，作图采用Origin 8.5软件完成，P小于0.05为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 Zein-DX糖基化产物接枝度和褐变强度分析

糖基化反应以美拉德反应为基础，即蛋白质的ε-氨基和多糖的还原羰基之间的反应，可以通过接枝度和褐变强度评价反应程度[10]。由图1可知，不同分子质量DX与Zein发生糖基化反应的接枝度不同，随着多糖分子质量的增加，糖基化产物的接枝度逐渐降低，且当DX分子质量增加到40 kDa和70 kDa时，糖基化产物的接枝度变化不显著。糖基化反应过程中能够产生褐色物质，使产物在420 nm波长处的吸光度增加，说明蛋白质与多糖之间发生了糖基化反应。DX分子质量对褐变强度的影响与接枝度相似，也是随着分子质量的增加而逐渐降低，这表明低分子质量（6 kDa）的DX具有更强的反应活性，Zein更容易与6 kDa的DX发生糖基化反应。Spotti等[11]在乳清蛋白与DX糖基化产物的研究中也得到类似的结果，这可能是由于低分子质量多糖的空间位阻较小，更容易靠近蛋白质的氨基，在相同的DX浓度下，更多的还原羰基参与糖基化反应，导致反应程度增大。

图1 Zein-DX糖基化产物接枝度和褐变强度（A420 nm）Fig. 1 Degree of graft (DG) and browning intensity (A420 nm) of Zein-DX glycosylation products

2.2 Zein-DX糖基化产物溶解度分析

图2 Zein-DX糖基化产物溶解度随pH值的变化Fig. 2 Changes in solubility of Zein-DX glycosylation products with pH

如图2所示，在pH 2～12范围内，Zein的溶解度较低，最高不超过30%。Zein在pH 6时溶解度最低，推断Zein的等电点可能在pH 6附近，这与杨光等[12]的研究结果一致。Zein与DX发生糖基化反应可以显著提高Zein在整个pH值范围内的溶解度，且不会改变Zein的等电点，这可能是由于Zein与DX结合后，在蛋白质分子中引入了亲水性羟基，增加了蛋白质和水分子的亲和力[13]。此外，蛋白质在等电点附近由于静电相互作用会发生聚集，然而Zein-DX糖基化产物在等电点附近具有比对照组Zein更高的溶解度，这表明DX能够为蛋白质提供空间位阻稳定作用[14]。随着DX分子质量的增加，Zein-DX糖基化产物的溶解度逐渐降低，但仍高于对照组Zein，说明低分子质量（6 kDa）的DX与Zein形成的糖基化产物具有更高的溶解度，这可能与较高的接枝度有关（图1）。

2.3 Zein-DX糖基化产物表面疏水性分析

蛋白质的表面疏水性（h0）与其分子结构的稳定性有关，这对于蛋白质的表面性质具有重要影响。由图3可知，与对照组Zein相比，Zein-DX糖基化产物的表面疏水性显著降低，这可能是由于亲水糖链的共价结合增加了蛋白质的亲水性[15]，以及多糖链的遮蔽作用使荧光探针难以与蛋白质分子内部的疏水基团结合[16]，从而导致蛋白质表面疏水性的降低。Zhang Yating等[17]对大豆蛋白-麦芽糊精糖基化产物的表面疏水性进行研究，发现糖基化作用会使蛋白质的表面疏水性降低，这与本研究得到的结果相似。随着DX分子质量的增加，Zein-DX糖基化产物的表面疏水性略有增加，但仍低于对照组Zein，即低分子质量（6 kDa）的DX与Zein形成的糖基化产物具有更低的表面疏水性，这可能与较高的接枝度有关（图1）。高接枝度的糖基化产物引入的亲水性羟基较多，进一步增加蛋白质表面亲水性，从而导致表面疏水性降低。Achouri等[18]在大豆11S球蛋白功能性质的研究中发现大豆球蛋白的表面疏水性随着接枝度的增加而逐渐降低，Mu Lixia等[19]研究发现随着更多的多糖与蛋白质共价结合，蛋白质表面疏水性降低得更快，这些研究均与本实验得到的结果一致。

图3 Zein-DX糖基化产物表面疏水性Fig. 3 Surface hydrophobicity of Zein-DX glycosylation products

2.4 Zein-DX糖基化产物乳化性分析

图4 Zein-DX糖基化产物EAI和ESIFig. 4 Emulsifying activity index (EAI) and emulsifying stability index(ESI) of Zein-DX glycosylation products

由图4可知，糖基化作用能够显著提高Zein的EAI和ESI，这可能是由于Zein分子中引入了带有亲水基团的DX，有效提高了蛋白质亲水性。此外，Zein-DX糖基化产物的空间结构变得松散，使蛋白质分子内部的疏水基团适当暴露，改善了蛋白质的亲水/疏水平衡，导致界面张力降低，从而提高了蛋白质的乳化性[20]。随着DX分子质量的增加，Zein-DX糖基化产物的EAI逐渐降低，表明低分子质量（6 kDa）DX的共价结合能够使Zein具有更高的EAI，说明Zein-DX6在油-水界面中具有较大的吸附量，能够阻止油滴聚集[21]，这可能与较高的接枝度有关（图1）。随着DX分子质量的增大，Zein-DX糖基化产物的ESI逐渐增加，这可能与高分子质量多糖具有较大的空间位阻作用有关。Pugnaloni等[22]研究发现蛋白质与多糖形成的糖基化产物具有较好的ESI，由于大分子多糖具有较大的空间位阻作用，在油水界面形成多分子层结构，有效减少油滴聚集，从而改善蛋白质乳化性，这与本实验的研究结果一致。

2.5 Zein-DX糖基化产物FTIR分析

FTIR是通过分子内原子间的振动引起辐射吸收，从而提供蛋白质的化学组成和构象结构信息[23]。由图5可知，对照组Zein具有3 个特征峰，分别为酰胺I带（1 600～1 700 cm-1）、酰胺II带（1 530～1 550 cm-1）、酰胺III带（1 240～1 450 cm-1），这与孙步云等[24]对玉米粉中蛋白质FTIR的研究结果类似。

图5 Zein-DX糖基化产物FTIRFig. 5 Fourier transform infrared spectra (FTIR) of Zein-DX glycosylation products

对于Zein-DX糖基化产物来说，在1 409 cm-1和1 694 cm-1处的吸收强度显著增加，这分别是由酰胺I带中C＝O伸缩振动和酰胺III带中C—N伸缩振动、N—H变形振动产生的。Su Junfeng等[25]将大豆分离蛋白与羧甲基纤维素进行糖基化反应，同样发现在酰胺I带和酰胺III带的吸收强度发生改变，这可能是糖基化过程中产生的希夫碱等中间产物引起吸收峰的增强。Zein-DX糖基化产物在1 000～1 260 cm-1波长范围内出现明显吸收峰，这是由糖分子中C—O—C糖苷键的伸缩振动产生的[26]；在3 396 cm-1处吸收强度增大是由于糖分子中游离—OH的伸缩振动引起的[27]，这说明Zein与DX以共价键形成了复合物。此外，在545、860 cm-1和2 928 cm-1处Zein-DX糖基化产物的吸收峰均变强，这可能是由CH3基团中C—H（sp3）反对称伸缩振动产生的[28]，进一步证实了Zein与DX形成了共价复合物。值得注意的是，随着DX分子质量的增加，Zein-DX糖基化产物的FTIR吸收强度增大。这表明尽管6 kDa的DX反应活性最大（图1），但是高分子质量多糖对Zein-DX糖基化产物FTIR吸收强度的影响更加显著。

蛋白质FTIR的酰胺I带（1 600～1 700 cm-1）主要是C＝O键的伸缩振动，可反映蛋白质的二级结构信息[29]。采用二阶导数红外去卷积光谱拟合法对二级结构进行定量分析，利用PeakFit v4.12软件对酰胺I带图谱进行拟合，根据Zhao Xiaoyan等[30]的报道，拟合图谱中各子峰与二级结构类型对应关系为1 650～1 660 cm-1为α-螺旋结构，1 610～1 640 cm-1为β-折叠结构，1 660～1 700 cm-1为β-转角结构，1 640～1 650 cm-1为无规则卷曲结构。通过计算各子峰面积与酰胺I带总峰面积之比，即可得到4种类型二级结构的含量，结果见表1。

表1 Zein-DX糖基化产物的二级结构含量Table 1 Secondary structure contents of Zein-DX glycosylation products%

由表1可以看出，对照组Zein的二级结构组成为35.46%的α-螺旋结构、25.62%的β-折叠结构、22.37%的β-转角结构和16.55%的无规则卷曲结构。Cabra等[31]在α-Zein二级结构的研究中发现α-螺旋是主要的二级结构，其含量达到40%，这与本实验的研究结果相近。与对照组Zein相比，Zein-DX糖基化产物的α-螺旋含量显著降低（P＜0.05），β-折叠和无规则卷曲含量显著增加（P＜0.05），β-转角含量变化不显著（P＞0.05）。蛋白质与多糖的糖基化作用主要是氨基与还原羰基的缩合反应，这发生在蛋白质分子α-螺旋结构及其附近区域内。α-螺旋结构的减少主要是由于多糖与α-螺旋结构内的氨基结合而导致的[32]。糖基化反应使Zein的二级结构发生显著改变，由有序的α-螺旋结构转变为无序的β-折叠和无规则卷曲结构，这表明Zein空间结构变得更加松散，蛋白分子结构展开，柔韧性增加[33]。Li Chen等[34]在花生分离蛋白糖基化复合物的研究中也发现了类似的现象。此外，随着DX分子质量的增加，Zein-DX糖基化产物的α-螺旋含量进一步降低，β-折叠和无规则卷曲含量进一步增加，表明高分子质量多糖的共价结合能够使Zein的分子构象变得更加灵活和松散，这可能与高分子质量多糖的空间位阻作用有关[35]。当DX分子质量增加到40 kDa和70 kDa时，Zein-DX糖基化产物的二级结构变化不显著（P＞0.05），说明多糖分子质量增加到一定程度时，不会对Zein分子二级结构产生更大的影响。

3 结 论

采用湿热法将Zein与不同分子质量DX发生糖基化反应，随着DX分子质量的增加，Zein-DX糖基化产物的接枝度和褐变强度降低，说明Zein更容易与低分子质量DX发生糖基化反应，这会导致糖基化产物具有更高的溶解度和更低的表面疏水性。乳化性分析表明，糖基化作用能够提高Zein的EAI和ESI，随着DX分子质量的增加，Zein-DX糖基化产物的EAI逐渐降低，ESI逐渐增加。FTIR证明了Zein与DX形成了糖基化共价复合物，对酰胺I带进行拟合分析表明，随着DX分子质量的增加，Zein-DX糖基化产物的α-螺旋含量降低，β-折叠和无规则卷曲含量增加，表明高分子质量多糖的共价结合能够使Zein的分子构象变得更加灵活和松散。