14 种侧耳属食用菌干品挥发性香味成分分析

殷朝敏，范秀芝，樊 喆，史德芳，高 虹*

侧耳属（Pleurotus）食用菌在分类学上隶属于担子菌门（Basidiomycota）、伞菌纲（Agaricomycetes）、伞菌目（Agaricales）、侧耳科（Pleurotaceae），是世界第二大人工栽培的食用菌[1-2]。侧耳属食用菌不仅富含多糖、三萜、凝集素、甾醇等生物活性成分，而且还拥有特殊的风味，深受消费者的青睐[3-4]。

研究表明，食用菌的风味主要由非挥发性的滋味物质和挥发性的香味物质组成，其中挥发性风味物质是食用菌香味的主要组分[5]。食用菌挥发性组分包括八碳化合物及其衍生物、萜烯类、含硫化合物以及醛类、酮类、酯类和酸类化合物等，其中八碳化合物和含硫化合物是核心成分，而醛、酮、酯酸类等与它们互补调和，因而呈现出食用菌的特殊香味[6-7]。目前研究者已通过水蒸气蒸馏、超临界CO2萃取、固相微萃取等方法对香菇（Lentinus edodes）[8-10]、金针菇（Flammulina velutipes）[5,11]、双孢蘑菇（Agaricus bisporus）[12-13]、羊肚菌（Morchella elata）[14]等食用菌的挥发性香味成分进行了研究，但是不同食用菌香味成分各不相同，有关侧耳属食用菌的挥发性香味成分研究相对较少。

本实验采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）和气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）方法对榆黄蘑（Pleurotus citrinopileatus）、红平菇（P. djamor）、秀珍菇（P. geesteranus）、糙皮侧耳（P. ostreatus）等14 种侧耳属食用菌的挥发性香味成分进行了分析，并通过相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）和共有成分分析研究不同组分对整体风味的贡献，以期为侧耳属食用菌的加工及品质调控提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 菌株培养与样品收集

侧耳属菌种包括榆黄蘑PY1、红平菇PH1、秀珍菇PX1、佛罗里达侧耳PF6（P. florida）、糙皮侧耳P739、糙皮侧耳P49、糙皮侧耳P03、美味侧耳P380（P. cornucopiae）、糙皮侧耳P51、糙皮侧耳P803、糙皮侧耳P650、糙皮侧耳P615、糙皮侧耳PH2、糙皮侧耳P712均购自于华中农业大学菌种中心。将活化的侧耳属菌种接种到灭好菌的棉籽壳袋料中（棉籽壳96%，麸皮3%，石膏0.5%，石灰0.5%），25 ℃静置培养30 d，待白色菌丝长满整个菌袋后，移至出菇房进行出菇管理[15-16]。收集子实体样品（直径约10 cm），置于50 ℃烘箱中低温干燥24 h至含水率为8%～10%，粉碎后过80 目筛，室温保存。

1.2 仪器与设备

手动SPME进样器、50/30 µm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）萃取头 美国Supeclo公司；7890A-5975C型GC-MS仪 美国Agilent公司；DF101S集热恒温磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；数显鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 挥发性风味物质的提取

分别称取3.0 g干粉样品于40 mL采样瓶中，加入20.0 mL蒸馏水和3.0 g NaCl，混匀后用聚四氟乙烯隔垫密封后置于60 ℃磁力搅拌器中平衡10 min后，再用萃取头顶空吸附40 min，完成后将萃取头插入GC-MS进样口，解吸5 min后进行GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS分析条件

GC条件[14,17]：色谱柱为Agilent HP-5ms非极性毛细管柱（60 m×250 μm，0.25 μm）；程序升温，初始温度40 ℃，保持2 min；以3 ℃/min的速率升至180 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率升至260 ℃，保持1 min；载气为高纯氦气，流速为1.0 mL/min；进样口温度250 ℃，不分流。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV，电压350 V，质量扫描范围m/z 50～450；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃。

1.3.3 化合物的鉴定

利用NIST11谱库的标准质谱图对得到的谱图数据进行串联检索和人工解析，选择匹配度大于80%作为物质鉴定依据。比对有关质谱资料，对基峰、m/z和相对丰度等方面进行分析，结合保留时间和MS对样品中各挥发性成分进行定性分析。釆用峰面积归一化法定量，得到各组分的相对含量（组分峰面积占总峰面积的百分比）。

1.3.4 主体挥发性风味物质的评定

采用ROAV评价各挥发性成分对样品总体风味的贡献[18-19]。定义对样品风味贡献最大的组分ROAV为100，则其他挥发性成分的ROAV小于100，按下式计算各挥发性成分的ROAV：

式中：Cri、Ti分别为挥发性成分的相对含量/%和气味阈值/（μg/kg）；Crstan、Tstan分别为对样品整体风味贡献最大组分的相对含量/%和气味阈值/（μg/kg）。ROAV≥1，说明该物质为样品的主体风味成分，且在一定范围内，ROAV越大说明该物质对总体风味贡献越大；0.1≤ROAV＜1，说明该物质对整体风味有修饰作用[20-21]。

2 结果与分析

2.1 不同侧耳属食用菌挥发性香味成分分析结果

采用50/30 µm DVB/CAR/PDMS萃取头，对14 种侧耳属食用菌中的挥发性香味物质进行富集，经GC-MS鉴定分析后，得到样品挥发性成分的总离子流图，如图1所示。经化学工作站数据处理及面积归一化法计算各组分相对含量，按各峰的质谱图经NIST.11谱库进行检索，在得到的挥发性物质中，存在一些硅氧烷类杂峰[21]，它们并不是侧耳属食用菌中所存在的挥发性物质。剔除这些物质后，14 种侧耳属食用菌干品中挥发性化合物匹配度大于80%的共41 种，其组成及相对含量如表1所示。

图1 榆黄蘑PY1干品挥发性成分GC-MS总离子流图Fig. 1 Total ion current chromatograms of volatiles extracted from P. citrinopileatus PY1 by GC-MS

由表1可知，鉴定出的41 种挥发性化合物占顶空挥发物总量的61.81%～96.44%，包括11 种醛类、11 种醇类、5 种酮类、2 种酯类、2 种羧酸类、2 种呋喃类、3 种烯烃类、2 种含氮化合物、1 种含硫化合物和2 种苯类化合物，其中相对含量较高的成分有1-辛烯-3-醇（32.98%～90.58%）、三辛酸甘油酯（1.25%～20.56%）、正己醛（0.03%～13.51%）、3-辛酮（0.34%～6.51%）和苯甲醛（0.26%～6.45%）等。在41 种挥发性化合物中有8 种化合物仅在个别样品中被检测到，占总峰面积的2.54%；此外，正己醛、2-丁基-2-辛烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、正辛醇、2-辛烯-1-醇、3-辛酮和1-辛烯-3-酮8 种挥发性香味成分是14 种侧耳属食用菌所共有的挥发性成分，但在不同菌中的相对含量有所差异，这些物质可能是侧耳属食用菌干品的关键性香味物质。

表1 14 种侧耳属食用菌干品挥发性香味组分及相对含量Table 1 Volatile compounds and their relative contents identified in 14 Pleurotus species

2.2 不同侧耳属食用菌干品挥发性香味成分种类分析

不同食用菌干品挥发性化合物的种类和相对含量也有较大差异，其中醇类化合物在14 种侧耳属食用菌中相对含量远高于其他类化合物，如图2所示。结合表1和图2可知，在样品PY1中共检出20 种挥发性香味成分，1-辛烯-3-酮在PY1中相对含量较高（2.84%），且其阈值极低（0.005 μg/kg）[22]，对PY1干品香味成分影响极大。另外，PY1中检出2 种特有挥发性组分2-乙基己醇（0.14%）和4-羟基丁酸（0.45%），而前者阈值极高（270 000 μg/kg）[22]，因此它对PY1干品香味成分影响并不大。PH1样品中共检出16 种挥发性成分，其中醇类物质含量较高（83.76%）。此外，2-辛烯醛在PH1中含量（2.15%）是所有样品中最高的，2-辛烯醛具有尖刺的脂肪、肉香、青香、黄瓜味道，且其阈值也较低（3 μg/kg）[22]，可能对PH1干品香味影响较大。PX1和PF6中分别检出18 种和20 种化合物，但二者醛类物质含量均较高，分别为13.14%和22.58%，鉴于醛类物质阈值较低，赋予香味能力强，可能对PX1和PF6干品香味有较大影响。此外，PF6中酯类物质和呋喃类物质含量也很丰富，分别达到14.21%和3.15%。P739、P49和P03样品中分别检出21、15 种和22 种挥发性成分，其中P739样品中醇类物质含量较高（88.47%）；P49中鉴定出的化合物只占挥发性物质总量的61.81%，尚有38.19%的化合物尚未被鉴定；而P03中醛类（8.73%）、酮类（7.77%）和酯类（20.85%）相对含量较高。P03中检出1 种特有挥发性组分异戊醛（0.24%），且苯甲醛（6.45%）、3-辛酮（6.51%）和三辛酸甘油酯（20.56%）的相对含量是所有样品中最高的。P380样品中检出16 种挥发性成分，其中醇类物质高达86.61%，而醛类物质只有3 种，相对含量为1.72%，与其他样品相比偏低。P51样品中检出12 种挥发性成分，未检出呋喃类、烯烃类、含氮化合物、含硫化合物和苯类化合物，是所有样品中检出挥发性成分种类最少的；12 种挥发性成分中醇类物质高达92.32%，而醛类物质只有3 种，相对含量也较低。P803、P650和P615样品中分别检出15、18 种和24 种挥发性成分，P803和P650中2-辛烯-1-醇含量较丰富，相对含量分别为3.16%和2.57%；P615中2-辛烯醛（2.08%）、3-辛醇（2.50%）、正辛醇（2.87%）、2-辛烯-1-醇（3.06%）、3-辛酮（3.10%）和1-辛烯-3-酮（4.25%）相对含量都较高，其中3-辛醇、正辛醇和1-辛烯-3-酮相对含量是所有样品中最高的。2 个高温种PH2和P712中分别检出21 种和12 种挥发性成分，其中PH2中2-辛烯-1-醇相对含量为5.06%，是所有样品中最高的；P712中醛类物质相对含量较高（9.21%），但是未检出酯类、呋喃类、烯烃类、含氮化合物、含硫化合物和苯类化合物。

图2 14 种侧耳属食用菌挥发性香味物质种类及相对含量Fig. 2 Classes and contents of volatile compounds identified in 14 Pleurotus species

2.3 14 种侧耳属食用菌主体挥发性香味成分分析

虽然食用菌干品中含有多种挥发性香味成分，但是只有一小部分对食用菌的整体风味有重要贡献，还有一些成分对整体风味进行修饰[13]。通常情况下，挥发性化合物对食用菌香气的贡献由其含量、气味阈值共同决定，—些含量低但气味阈值也很低的化合物也可能对食用菌的整体风味起重要作用[19]。

14 种侧耳属食用菌干品挥发性香气成分的ROAV见表2。PY1样品中主体挥发性香味成分（ROAV≥1）有2 种，分别是1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇；起修饰作用的香味成分（0.1≤ROAV＜1）也有2 种，分别是壬醛和2-壬烯醛。1-辛烯-3-酮具有强烈的壤香、蘑菇香，而1-辛烯-3-醇具有蘑菇香、青香、蔬菜香及油腻的气息[22]；壬醛具有蜡香、甜桔香、脂肪香和花香；而2-壬烯醛具有脂肪气息、青香、蜡香、黄瓜香和甜瓜香[22]，这些化合物共同形成了榆黄蘑PY1特殊的香味。PH1样品中主体挥发性香味成分（ROAV≥1）也是1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇，但发挥着修饰作用（0.1≤ROAV＜1）的物质有3 种，分别是2-壬烯醛、2-辛烯醛和正辛醛。2-辛烯醛具有尖刺的脂肪、肉香、青香、黄瓜味道；正辛醛具有似甜橙、油脂、蜂蜜香气[22]，这些化合物对红平菇PH1独特的香气有重要修饰作用。PX1、P739、P49、P03和P380样品中主体挥发性香味成分（ROAV≥1）均为1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇；PX1中发挥着修饰作用（0.1≤ROAV＜1）的物质是正辛醛和壬醛，而P739和P380中发挥着修饰作用（0.1≤ROAV＜1）的物质均只有1 种，分别是正辛醛和正己醛，后者具有强烈的青香、草香、蔬菜和水果香气[22]；P49中起修饰作用（0.1≤ROAV＜1）的挥发性物质有3 种，ROAV从大到小分别为正辛醛、壬醛和正己醛；P03样品中起修饰作用（0.1≤ROAV＜1）的挥发性物质也有3 种，分别为异戊醛、正己醛和3-辛酮；其中3-辛酮具有酮香、青香、蜡香、蔬菜香等[22]。PF6中主体挥发性香味成分（ROAV≥1）有3 种，分别为1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇和正辛醛；另外，正己醛和2-戊基呋喃是佛罗里达侧耳PF6香味的重要辅助成分（0.1≤ROAV＜1），其中2-戊基呋喃具有果香、奶酪、酸性乳制品的香气。P51样品中主体挥发性香味成分是1-辛烯-3-醇（ROAV=100）和1-辛烯-3-酮（ROAV=99.36），没有发现修饰成分。P803、P650、P615、PH2和P712中主体挥发性香味成分（ROAV≥1）均为1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇；P803中修饰成分（0.1≤ROAV＜1）有正辛醛、正己醛、壬醛和2-辛烯醛；P650中重要修饰成分（0.1≤ROAV＜1）也有4 种，分别是2-辛烯醛、正己醛、壬醛和苯乙醛，后者具有青香、玫瑰、花香、巧克力香气[22]；P712中起重要修饰作用的物质有2 种，分别是正己醛和2-辛烯醛。另外，有部分挥发性化合物因为无法查询到相应的感觉阈值而未作具体分析。

表2 14 种侧耳属食用菌干品中主体挥发性物质及对应ROAVTable 2 ROAV of key flavor compounds in 14 Pleurotus species

2.4 14 种侧耳属食用菌共有成分分析

表3 主成分分析的特征值Table 3 Eigenvalues of principal component analysis

表4 主成分分析的特征向量Table 4 Eigenvectors of principal component analysis

14 种侧耳属食用菌中共检出8 种共有的挥发性成分，以8 种共有的香气成分相对含量构成的14×8的矩阵，利用SPSS 21.0进行主成分分析，提取特征值大于1的主成分，结果如表3和表4所示。第1主成分方差贡献率为41.456%，其中1-己醇、正己醛和2-丁基-2-辛烯醛贡献最大，对应的特征向量分别为0.875、0.859和0.806；1-己醇具有青香、果香、醇香和甜香[22]，正己醛具有强烈的青香、草香、蔬菜和水果香气[22]，而2-丁基-2-辛烯醛具有肉香味[23]，故第1主成分主要反映侧耳属食用菌中的青香、果香及肉香；第2主成分方差贡献率为23.015%，正辛醇和2-辛烯-1-醇贡献最大，对应的特征向量分别为0.882和0.849，正辛醇和2-辛烯-1-醇具有强烈的油脂气味，并带有柑橘、玫瑰气味，因此第2主成分主要反映侧耳属食用菌中的油脂味；第3主成分方差贡献率为19.156%，1-辛烯-3-酮和3-辛酮的贡献率最大，对应的特征向量为0.816和0.784；1-辛烯-3-酮具有强烈的壤香、蘑菇香；而3-辛酮具有酮香、青香、蜡香、蔬菜香，故第3主成分主要反映侧耳属食用菌中的蘑菇香和酮香；3 个主成分方差累计贡献率达到83.627%，可基本反映总体情况。

3 讨 论

研究表明，栽培袋料和生长环境对食用菌次级代谢产物的产生有重要影响[24-25]，本实验中以棉籽壳为基料并统一栽培环境，消除了外界环境对侧耳属食用菌挥发性香味成分的影响，但是不同样品中挥发性化合物的种类和相对含量仍然有差异较大。另外，同属于糙皮侧耳的P739、P49、P03、P51、P803、P650、P615、PH2和P712样品的挥发性化合物也存在较大差异，如P03中检测到22 种挥发性物质，而P51和P712中只检测到12 种挥发性物质，这表明种以及菌株个体差异对食用菌挥发性香味成分有较大影响。

八碳化合物（C8H16O）是食用菌最重要的风味物质，是亚油酸及亚麻酸在脂肪氧化酶催化下转变而成的物质，主要包括1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、3-辛醇、3-辛酮和正辛醇等[26-27]。其中1-辛烯-3-醇具有浓烈的蘑菇味道，普遍存在于大部分食用菌中[7]，是食用菌的特征性香味成分。在本研究的14 种侧耳属食用菌样品中均检测到1-辛烯-3-醇的存在，且相对含量较高，为32.98%～90.58%。1-辛烯-3-酮具有强烈的壤香、蘑菇香；3-辛酮具有酮香、青香、蜡香、蔬菜香，且二者阈值较低，是食用菌关键性香味物质，本实验14 个样品中均含有这2 种香味成分。

在进行挥发性物质的种类和含量分析时发现醇类化合物在14 种侧耳属食用菌中相对含量远高于其他类化合物。张莹[28]研究几种食用菌香味物质时发现糙皮侧耳中醛类物质含量最高；Tsai等[29]研究白灵菇（Pleurotus ferulae）、糙皮侧耳香味物质时均检测到高含量的酮类化合物；而李秦等[30]发现黑平6号中酸类物质含量最高。这与本实验研究结果有一定差异，可能是因为研究采用的萃取方法不同有关；另外，挥发性物质的含量可能还与食用菌的种类、生长环境和成熟度等因素有关[20]。

挥发性香味成分是食用菌品质的重要指标，通过研究分析食用菌挥发性香味物质的组成和含量有助于深入了解其风味特征，对品种的改良、定向培育及食用菌的加工应用具有指导作用和实践意义[7]。本实验采用HSSPME方法提取了14 种侧耳属食用菌干品中的挥发性香气物质，经GC-MS初步鉴定出41 种挥发性香气成分，其中榆黄蘑PY1干品20 种，红平菇PH1中16 种，秀珍菇PX1中18 种，佛罗里达侧耳PF6中20 种，美味侧耳P380中16 种，9 个糙皮侧耳干品中最高的24 种（P615），最低的12 种（P51和P712）。不同食用菌干品挥发性成分的种类和含量差异很大，除PF6中主体挥发性香气成分（ROAV≥1）有3 种（1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇和正辛醛）之外，余下13 种食用菌中主体挥发性香气成分（ROAV≥1）均为1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇。此外，侧耳属食用菌中还存在一些重要的修饰性香气成分，如1-己醇、正己醛、2-丁基-2-辛烯醛、正辛醇、2-辛烯-1-醇、1-辛烯-3-酮和3-辛酮等，这些众多组分相互作用形成了侧耳属食用菌干品的独特香气。