三叶青原花青素结构分析

李 鑫，刘景玲，李 彦，郭万里，王大巾，梁宗锁,,*

原花青素又称为缩合单宁，为一类广泛存在于植物不同组织中的多酚类物质，具有抗氧化、抗肿瘤、抗微生物、保护心脑血管、抗糖尿病、减肥、美白等多种保健功能，同时具有良好的生物安全性，可被用作天然的植物功能性成分，营养添加剂等，受到了越来越多的关注[1-5]。原花青素由黄烷-3-醇结构单元缩合而成，比较常见的有由（表）儿茶素缩合形成的原花青定（procyanidin，PC）以及由（表）没食子儿茶素缩合形成的原翠雀定（prodelphinidin，PD）等，不同结构原花青素的差异主要由结构单元B环上的R1及C环上C2和C3的立体型决定，结构单元C环上的R2可被酰基化或糖基化，通常为没食子酰基化[3]。结构单元的连接方式有以C4—C6或C4—C8单连接键形成B型连接，以及以一个C—C键及一个C—O—C键的双连接键形成A型连接[5-6]。根据聚合度的不同，原花青素可分为单体、低聚和高聚原花青素，如图1所示[6]。结构单元、连接方式、C环上R2取代基以及聚合度的异质性，共同构成了原花青素结构上的复杂性和多样性[5-8]。

图1 典型的黄烷-3-醇单体及原花青素结构Fig. 1 Typical chemical structures of flvan-3-ol monomer units and proanthocyanidins

核磁共振碳谱（13C nuclear magnetic resonance，13C NMR）、反相高效液相色谱-电喷雾质谱（reversedphase high performance liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry，RP-HPLC-ESI-MS）联用以及基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）被认为是分析原花青素结构的有效手段[9-10]。利用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20可以比较方便地从含有原花青素的植物提取物中获得纯化的原花青素[10]。13C NMR能够在一定程度上提供结构单元的类型及比例、聚合度、连接方式、结构单元的空间构型及取代基信息[11-13]。对原花青素化学降解产物进行RPHPLC-ESI-MS分析可获得原花青素末端单元和延伸单元组成和平均聚合度信息[9-10,14]。MALDI-TOF MS作为一种软离子化质谱技术，被认为是一种可以获得原花青素较为全面的结构信息的工具，通过MALDI-TOF MS可以获得原花青素结构单元的组成比例及连接方式，聚合度的分布范围及取代基信息等[15-16]。在实际应用中，通常需要将多种手段结合起来，以获得原花青素全面的结构信息[5-10]。

三叶青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg），又名三叶崖爬藤，为葡萄科崖爬藤属植物，为中国特有的珍稀植物[17]。三叶青全草都是宝，大量研究认为，三叶青具有很好的抗氧化、抗炎、解热、阵痛、抗病毒、抗肿瘤功效[18-23]，被认为是一种“药食两相宜”的珍稀佳品。三叶青的化学成分较为复杂，主要有黄酮、酚类、多糖、脂肪酸、磷脂、糖酯以及苯磺酸等[24-25]，三叶青的活性成分可能为黄酮和酚类物质[20-23]。原花青素同时具有黄酮和酚的化学性质，三叶青含有原花青，现有文献报道的三叶青原花青素主要为儿茶素和表儿茶素2 种单体，原花青素B1、原花青素B2等几种二聚体以及一种三聚体[26-30]，鲜见有关三叶青原花青素结构更为全面的报道。

本实验采用溶剂提取，葡聚糖凝胶Sephadex LH-20纯化的方法从三叶青根、茎、叶中制备原花青素，并利用13C NMR，RP-HPLC-ESI-MS联合MALDI-TOF MS技术对纯化的三叶青原花青素进行结构分析，以期为三叶青原花青素的基础研究和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三叶青采自浙江杭州三叶青农业科技有限公司，经浙江理工大学生命科学学院梁宗锁教授鉴定为葡萄科崖爬藤属植物三叶青。将三叶青按根、茎及叶分开，以去离子水洗净，切碎，50 ℃烘干，粉碎并过40 目筛，-20 ℃保存备用。

氘代二甲亚砜（dimethyl sulfoxide-D6，DMSO-D6）、苄硫醇、氯化铯（纯度≥99.999%）、Dowex®50W X8氢型强酸性阳离子交换树脂（200～400 目）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（色谱纯），儿茶素、表儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯（均为分析标准品） 美国Sigma-Aldrich公司；葡聚糖凝胶Sephadex LH-20 美国GE公司；2’,5-二羟基苯甲酸（2’,5-dihydroxybenzoic acid，DHB） 美国赛默飞世尔科技公司；甲醇、丙酮、乙腈（均为色谱纯） 美国TEDIA公司；其他试剂为国产分析纯，实验用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

UV-1700紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；AVANCE III 500核磁共振波谱仪 瑞士布鲁克公司；4700 MALDI-TOF/TOF质谱仪 美国ABI公司；1525二元高效液相色谱系统、2996光电二极管阵列检测器美国Waters公司；LTQ-XL线性离子阱质谱仪 美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 三叶青原花青素的提取及纯化

分别取三叶青根、茎、叶粗粉100 g，加入1 000 mL体积分数70%丙酮溶液静置30 min，然后设定提取时间30 min、温度40 ℃、功率600 W进行超声波辅助提取，共提取3 次。提取液以布氏漏斗抽滤，合并滤液，浓缩液以1∶3（V/V）比例多次加入石油醚萃取，以充分除去浓缩液中的脂溶性物质，将脱脂后的浓缩液冻干备用。

分别取葡聚糖凝胶100 g，以体积分数50%甲醇溶液充分溶胀，取层析柱（30 mm×600 mm）湿法装柱，然后以体积分数50%甲醇溶液平衡12 h。取冻干的提取物，以少量的体积分数50%甲醇溶液溶解后上样，以体积分数50%甲醇溶液充分洗脱，直至流出液在波长280 nm处无吸收，换用体积分数70%丙酮溶液洗脱，收集洗脱液，40 ℃条件下减压浓缩以除去丙酮，冻干，即得到纯化的三叶青原花青素，-20 ℃保存备用。

1.3.2 三叶青原花青素结构分析

1.3.2.113C NMR分析

取100 mg样品以500 μL DMSO-D6溶解，用AVANCE III 500核磁共振波谱仪采集13C NMR数据，扫描频率126 MHz，脉冲角45°，延迟时间3 s。

1.3.2.2 苄硫醇降解

于试管中依次加入200 μL的5 mg/mL样品甲醇溶液，200 μL的体积分数3.3%的盐酸-甲醇溶液以及400 μL的体积分数5%的苄硫醇-甲醇溶液，密封并混匀，40 ℃水浴30 min，冰浴冷却，过0.22 μm滤膜后进行RP-HPLC-ESIMS分析。

1.3.2.3 RP-HPLC-ESI-MS分析

使用Waters 1525二元高效液相色谱仪及LTQ-XL线性离子阱质谱仪对三叶青不同部位原花青素硫解产物进行分析。色谱柱为Waters XBridge BEH Shield RP18柱（4.6 mm×250 mm，130 Å，5 µm）。二元梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为0.5%的TFA溶液，线性洗脱梯度如下：0～45 min，12%～80% A；45～50 min，80%～12% A。进样量20 μL，流动相流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，检测波长280 nm。

ESI-MS使用RP-HPLC的色谱参数，分流比1∶3，质谱条件：毛细管温度400 ℃，电喷雾电压4.50 kV，鞘气压力50 psi，辅助气体压力10 psi，源内碰撞诱导解离能量（Source CID）10 V，碰撞能量50 V，负离子扫描模式，质量扫描范围m/z 100～800。

三叶青原花青素硫解产物根据色谱保留时间和质谱数据进行定性，平均聚合度（mean degree of polymerization，mDP）根据色谱的峰面积计算，计算公式参考文献[14]：mDP=1＋延伸单元总峰面积/末端单元总峰面积。

1.3.2.4 MALDI-TOF MS分析

使用DHB作为基质，氯化铯作为离子化试剂。样品和基质分别以10 mg/mL溶于体积分数30%丙酮溶液，以Dowex®50W X8氢型强酸性阳离子交换树脂进行充分的去离子处理，去离子后的样品与1.52 mg/mL氯化铯溶液以1∶1（V/V）的比例充分混匀，混匀液立即与去离子后的基质按照1∶3（V/V）的比例充分混匀，立即取1.0 μL点于洁净的不锈钢靶上，室温条件下挥干溶剂，进行质谱分析。

本研究使用ABI 4700 MALDI-TOF/TOF质谱仪对样品进行分析。测定条件：正相氮气激光器，波长337 nm，脉冲宽度3 ns，采用反射模式进行分析，加速电压20.0 kV，反射电压23.0 kV，最优质量分辨率2 000 Da，正离子扫描模式，质量扫描范围为900～3 600 Da，结果由200～500 次激光激发累加得到。分析前使用外标血管紧张素II（1 046.5 Da）、蛙皮素（1 619.8 Da）、ACTHclip18～39（2 465.2 Da）和生长激素抑制素28（3 147.47 Da）对靶进行校准。

1.4 数据统计分析

三叶青原花青素苄硫醇降解实验进行3 次重复，结果以 ±s表示，采用SPSS 22.0对数据进行单因素方差分析（One-way ANVOA），P＜0.05，具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 13C NMR分析

图2 三叶青根（A）、茎（B）及叶（C）原花青素的13C NMR谱图Fig. 2 13C NMR spectra of proanthocyanidins from root (A), stem (B)and leaves (C) of T. hemsleyanum

采用13C NMR对三叶青原花青素结构进行分析，如图2所示。根据文献[7-13]对谱图中峰信号进行解析，1号峰位于化学位移为δ 157～150之间，为A环上的C5、C7及C8的信号。2号峰位于δ 146处，为PD的C3’、C5’的信号，3号峰位于δ 145处，为PC的C3’、C4’的信号。δ 131附近的4号峰，为PC的C1’，PD的C1’、C4’的信号。δ 118附近的5号峰为PC的C6’的信号，δ 115附近的6号峰为PC的C2’及C5’的信号。7号峰位于δ 106附近，为PD的C2’及C6’，延伸单元的C8，2,3-反式构型中延伸单元的C4a的信号，δ 101附近的8号峰为2,3-顺式构型中延伸单元的C4a信号，δ 99附近的9号峰为末端单元的C4a信号，而δ 95附近的10号峰为C6及末端单上C8的信号。11号峰位于δ 83附近，为2,3-反式构型C2的信号，而2,3-顺式构型C2的信号为出现在δ 76处的12号峰，δ 72和δ 66附近的13、14号峰分别为延伸单元及末端单元的C3信号。δ 39.5附近的15号峰为溶剂DMSO-d6的碳信号。δ 36及δ 28附近的16、17号峰分别延伸单元及末端单元的C4信号。

三叶青根、茎及叶原花青素的13C NMR谱图中都可以同时观测到位于δ 146处的PD的C3’、C5’信号和δ 145处的PC的C3’、C4’信号，且PD信号的峰面积小于PC信号，说明三叶青不同部位原花青素主要由PC和PD构成，且以PC为主。在δ 83附近观测到属于2,3-反式构型C2的信号，且信号强度远低于δ 76附近的属于2,3-顺式构型C2的信号，表明三叶青不同部位原花青素均含有2,3-顺式和2,3-反式构型，且以2,3-顺式构型为主。由于采集到的谱图分辨率不够高，难以获得更进一步的结构信息。

2.2 硫解产物的RP-HPLC-ESI-MS分析

对原花青素的硫解产物进行RP-HPLC-ESI-MS分析，可获得原花青素末端单元和延伸单元组成以及聚合度信息，在酸性环境中，亲核试剂苄硫醇可降解原花青素，末端单元以黄烷-3-醇的形式被释放出来，延伸单元与苄硫醇形成对应的苄硫醚加合物，对降解产物进行分析可推测原花青素的结构[9-10]。在苄硫醇的降解过程中，原花青素结构单元C环C2和C3的立体构型不受影响，被认为是一种分析原花青素结构的有效手段[14]。

注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

图3 三叶青根（A）、茎（B）、叶（C）原花青素硫解产物及分析标准品（D）的HPLC图Fig. 3 HPLC spectra of thiolytic degradation products of proanthocyanidins from root (A), stem (B), and leaves (C) of T. hemsleyanum and analytical standards (D)

本实验利用RP-HPLC-ESI-MS对原花青素苄硫醇降产物进行分析，如图3所示。三叶青不同部位原花青素具有相同的结构单元，但组成比例上有所不同。峰1～4的分子离子[M-H]-分别为m/z 289、289、441、441，通过比对分析标准品的保留时间及质谱数据，确定峰1～4分别为儿茶素、表儿茶素、儿茶素没食子酸酯及表儿茶素没食子酸酯，为原花青素的末端单元。峰5～11的分子离子[M-H]-分别为m/z 427、427、579、411、411、563及123，通过比对质谱数据并结合参考文献[10]鉴定为没食子儿茶素苄硫醚、表没食子儿茶素苄硫醚、表没食子儿茶素没食子酸酯苄硫醚、儿茶素苄硫醚、表儿茶素苄硫醚、儿茶素没食子酸酯苄硫醚及过量的苄硫醇。

如表1所示，三叶青不同部位原花青素的末端单元主要为儿茶素和表儿茶素，含有少量的儿茶素没食子酸酯及表儿茶素没食子酸酯；延伸单元由表儿茶素、儿茶素、表没食子儿茶素、没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯以及表没食子儿茶素没食子酸酯组成，且以表儿茶素和表没食子儿茶素为主。C环C2和C3的立体构型以2,3-顺式为主。

通过对三叶青原花青素硫解产物RP-HPLC-ESI-MS的分析，三叶青根、茎及叶原花青素主要为（表）儿茶素和（表）没食子儿茶素组成的PC和PD，此外，还含有少量的由（表）儿茶素没食子酸酯组成的原花青定没食子酸酯和由表没食子儿茶素没食子酸酯组成的原翠雀定没食子酸酯，与13C NMR分析结果基本一致，但RP-HPLCESI-MS由于具有更高的灵敏度，检测出了13C NMR未能检测出的（表）儿茶素没食子酸酯及表没食子儿茶素没食子酸酯结构单元，并发现没食子酰基化的结构单元主要存在于延伸单元。利用RP-HPLC-ESI-MS分析获得了三叶青原花青素准确的mDP，三叶青根、茎及叶原花青素的mDP分别为4.89±0.33、3.77±0.19及4.45±0.48。

2.3 MALDI-TOF MS分析

尽管利用13C NMR和RP-HPLC-ESI-MS从不同角度获得了三叶青原花青素的结构信息，但无法获得三叶青原花青素聚合度的分布和连接情况的信息。MALDI-TOF MS作为一种高灵敏度的软离子化质谱，在分析非挥发性物质的结构上具有独到的优势，被认为是分析原花青素结构多样性的有效工具。MALDI-TOF MS能够直接给出不同聚合度、不同分子质量原花青素准确的分子离子峰，可用于研究原花青素的基本结构单元、聚合度的分布范围以及连接方式[9-10]。使用MALDI-TOF MS技术分析原花青素可能会受基质种类、样品去离子化情况、阳离子化试剂的选择、激光强度、样品和基质的混匀程度等多种因素的影响，因此，必须综合考虑这些因素以获得原花青素“准确”的结构信息[31-32]。

本研究采用反射模式，对三叶青原花青素进行去离子处理后，引入阳离子化试剂Cs＋并使用DHB为基质，使用ABI 4700 MALDI-TOF/TOF质谱仪获得了三叶青原花青素清晰的MALDI-TOF MS图，如图4所示。三叶青原花青素的质谱图非常复杂，周期性分布的峰体现了三叶青原花青素结构上多分散性和复杂性，表明三叶青不同部位的原花青素为分散的多聚体。根据13C NMR和RP-HPLC-ESI-MS的分析结果，三叶青不同部位的原花青素均为主要由（表）儿茶素、（表）没食子儿茶素以及（表）儿茶素没食子酸酯等结构单元构成的原花青素多聚体，参考周海超等[15]的方法，建立解析方程：[M＋Cs]＋=133＋2＋288a＋304b＋152c-2d，其中，m/z 133是Cs＋的相对原子质量，m/z 2代表2 个末端H，a、b、c及d分别代表（表）儿茶素（m/z 288）、（表）没食子儿茶素（m/z 304）、没食子酰基（m/z 152）以及A型连接在原花青素分子中的个数，将由解析方程和计算出的理论[M＋Cs]＋值和实际测得的[M＋Cs]＋值进行比较，发现二者能够互相吻合（表2），表明所建立的解析方程是可信的。

图4 三叶青根（A）、茎（B）及叶（C）原花青素MALDI-TOF MS图Fig. 4 MALDI-TOF mass spectra of proanthocyanidins from roots (A),stem (B) and leaves (C) of T. hemsleyanum

从图4及表2可以看出，三叶青不同部位原花青素在聚合度分布和连接类型上具有较高的相似性，但不完全一致，三叶青根、茎原花青素可以观测到从三聚体（m/z 999）到十聚体（m/z 3015）分布的多聚体，三叶青叶原花青素则可以观测到高达十一聚体（m/z 3319）的多聚原花青素，三叶青根、茎及叶质谱图中离子峰最强的都是一个四聚体（m/z 1 303），而每个聚体内部的聚合物都存在由于结构单元的不同或者结构单元之间连接方式不同而形成的差异，三叶青根、茎及叶原花青素从三聚体到十聚体中离子峰最强的m/z序列分别为1 015-1 303-1 575-1 879-2 167-2 439-2 743-3 031、1 015-1 303-1 591-1 879-2 199-2 471-2 791-3 079以及999-1 303-1 591-1 895-2 183-2 487-2 775-3 079，且在离子峰最强的m/z信号附近可观测到一系列相差16 Da的离子峰信号（图4A、C中放大的五聚体），如1 575-1 591-1 607-1 623，而16 Da是一个（表）没食子儿茶素结构单元和一个（表）儿茶素结构单元之间的分子质量差值，因此认为在每个聚体内部，存在着一系列由不同个数（表）没食子儿茶素结构单元和（表）儿茶素结构单元构成的复杂连接，如离子峰m/z 1 575是由5 个（表）儿茶素结构单元构成的五聚体，而离子峰m/z 1 591则是由4 个（表）儿茶素和1 个（表）没食子儿茶素构成的五聚体，离子峰m/z 1 607则是由3 个（表）儿茶素和2 个（表）没食子儿茶素构成的五聚体，离子峰m/z 1 623则是由2 个（表）儿茶素和3 个（表）没食子儿茶素构成的五聚体。

表2 MALDI-TOF MS分析三叶青根、茎及叶原花青素Table 2 MALDI-TOF MS analysis of proanthocyanidins from roots,stem and leaves of T. hemsleyanum

续表2

续表2

从三叶青根、茎及叶的原花青素质谱图中（图4A、C中放大的五聚体），从三聚体到十聚体都能够观察到一系列和主要离子峰相差152 Da的离子峰，而152 Da是一个没食子酰基的分子质量，表示三叶青原花青素中普遍存在没食子酰基。而根据RP-HPLC-ESI-MS的结果，认为没食子酰基主要以延伸单元上的表儿茶素没食子酸酯的形式存在，结合MALDI-TOF MS结果，认为每个含有没食子酰基的原花青素分子中，只含有一个没食子酰基，三叶青不同部位原花青素都有一定程度的没食子酰基化，没食子酰基化程度从高到低依次为叶、根及茎原花青素。

多聚原花青素结构单元之间的连接方式，除了以C4—C6或C4—C8单连接键构成的B型连接，还能够以1个C—C键及1个C—O—C键的双连接键形成A型连接，A型连接比B型连接多消耗2 个H，则当聚合度不变的情况下，含有A型连接的原花青素分子质量小于不含A型连接的原花青素，反映到MALDI-TOF MS谱图上，则会观测到一系列相差2 Da的离子峰序列[5]（图4B中放大的三聚体）。以三叶青茎原花青素放大的三聚体部分为例，从谱图中可清晰地观测到一系列差值为2 Da的离子峰序列如m/z 995-997-999、m/z 1 011-1 013-1 015以及m/z 1 027-1 029-1 031等，说明A型连接的存在，通过MALDITOF MS分析，三叶青根、茎及叶原花青素的三聚体至九聚体均检出A型连接的存在，除部分三聚体含有2 个A型连接外，其他聚体的原花青素至多检出1 个A型连接，说明三叶青不同部位原花青素中普遍存在A型连接。

3 结 论

原花青素是由黄烷-3-醇结构单元缩合形成的复杂植物多酚，本研究利用溶剂提取，葡聚糖凝胶Sephadex LH-20纯化的方法，从采自浙江杭州的三叶青根、茎及叶中得到了纯化的原花青素。利用13C NMR、RP-HPLCESI-MS联合MALDI-TOF MS技术对三叶青不同部位的原花青素进行了结构分析。结果表明三叶青根、茎及叶原花青素主要由PC和PD构成，三叶青不同部位原花青素的末端单元以儿茶素为主，延伸单元以表儿茶素和表没食子儿茶素为主，三叶青根、茎及叶原花青素的mDP分别为4.89±0.33、3.77±0.19及4.45±0.48。利用MALDITOF MS检测出三叶青根、茎原花青素的三聚体到十聚体，叶原花青素的三聚体到十一聚体，每个聚体内部普遍存在（表）儿茶素和（表）没食子儿茶素结构单元，没食子酰基化以及A型连接。三叶青根、茎及叶原花青素在结构上具有一定的相似性。本研究结果可为三叶青原花青素的基础研究和开发利用提供参考。