花椒麻味物质替代模板分子印迹聚合物的制备

李 耀，何叶子，陈光静,2,3，阚建全,2,3,*

花椒（Zanthoxylum bungeanum）含有多种生理活性成分，如挥发油类、生物碱类和酰胺类物质，目前从花椒中分离纯化得到的酰胺类物质主要是α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素及其羟基山椒素（图1），这类酰胺物质被称为花椒麻味物质（numb-taste components of Z. bungeanum，NTCZB），山椒素是最能代表花椒引起麻刺感的成分。NTCZB具有麻醉、抑菌、祛风除湿、杀虫和抗氧化等功效，具有很好的应用价值[1-2]。但NTCZB在空气中不稳定，目前还没有市售的标准品，传统分离纯化方法存在繁琐、成本高等缺点，而NTCZB的结构、性质、含量等方面还有待深入研究，因此迫切需要研究出NTCZB更加高效的分离纯化方法[3-4]。分子印迹技术为NTCZB的分离纯化提供了新的思路。在分子印迹技术中，采用与印迹分子结构相似的化合物作为替代模板分子，可以解决一些印迹分子难获得、溶解性差等问题[5-6]。用替代模板分子制备的分子印迹聚合物（molecular imprinting polymers，MIPs）对目标印迹分子仍具有较好的印迹效果[7-8]。近些年替代模板分子印迹技术快速发展，但目前鲜见有关采用替代模板分子制备NTCZB的MIPs相关报道。

NTCZB标准品制备过程繁杂、成本高，其分子链上的多个不饱和碳碳双键容易发生共价键化学反应，使NTCZB不易洗脱[9]。为解决上述问题，本实验采用山椒素的结构类似物（molecular structural analogs of alkyl amides，LM，见图1d）为NTCZB分子印迹的替代模板分子（理论相对分子质量为271），采用本体聚合的方法制备多种NTCZB的MIPs，从中选出对NTCZB的印迹效果最优的MIPs，并用其吸附花椒萃取液中的NTCZB，为高纯度NTCZB的分离纯化奠定基础，同时也为具有类似结构特点物质的分子印迹技术提供方法借鉴。

图1 NTCZB主要成分及LM的分子结构图Fig. 1 Molecular structures of numb-taste components of Z. bungeanum and structural analogs of alkyl amides

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

NTCZB标准品（纯度＞95%），由实验室按照逆流干柱层析法、制备型高效液相色谱法等工序制备[10]；LM（纯度＞95%）由实验室按照Menozzismarrito等[11]提供的方法制备；鲜花椒 重庆凯扬农业有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EDMA）、2-乙烯基吡啶（2-vinylpyridine，2-Vpy）、甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）、丙烯酰胺（acrylamide，AM）（均为分析纯） 阿拉丁公司；偶氮二异丁腈（2,2-azobisisobutyronitrile，AIBN）、氯仿、甲醇、冰乙酸、乙腈（均为分析纯） 成都科隆试剂公司；实验用水为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

DSHZ-300型水浴振荡仪 苏州市培英实验设备有限公司；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；5810型离心机 德国艾本德公司；超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；1260型高效液相色谱仪 美国Agilent公司；CP214型电子天平 奥豪斯仪器上海有限公司；UV-260型紫外光谱仪 日本岛津公司；Equinox55傅里叶变换红外光谱仪 德国Bruker公司；S-3400N I型扫描电子显微镜 日本Hitachi公司；R215旋转蒸发器 瑞士Büchi公司。

1.3 方法

1.3.1 LM与功能单体混合溶液的紫外吸收光谱测定[12-13]

分别吸取LM-乙腈溶液100 μL、功能单体（2-Vpy、AM、MAA）的乙腈溶液200 μL及LM与功能单体混合物（物质的量比为1∶2）于10 mL比色管中，乙腈定容，超声10 min后，于4 ℃避光静置12 h，以乙腈作为参比溶液，在波长190～400 nm进行紫外光谱扫描。

1.3.2 不同物质的量比的功能单体与LM的紫外光谱扫描

固定LM-乙腈溶液1 mL于10 mL比色管中，分别加入功能单体（2-Vpy、AM、MAA）的乙腈溶液，使LM与功能单体物质的量比分别为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，乙腈定容，超声10 min后在4 ℃环境下避光保存12 h，以相同浓度功能单体为参比溶液，在190～400 nm波长范围内进行紫外光谱扫描。

1.3.3 NTCZB的MIPs制备

MIPs的不同聚合条件见表1。以实验组编号1为例，聚合物的制备过程具体如下[14]：称取67.75 mg（0.25 mmol）LM于50 mL圆底烧瓶中，加入12 mL乙腈溶解，然后加1 mmol功能单体MAA，超声30 min，使其充分溶解，5 ℃避光放置过夜，使LM和功能单体充分作用；加入4 mmol交联剂EDMA和10 mg引发剂AIBN，充分溶解后，向混合液中通氮气20 min，使瓶内保持惰性氛围，并在氮气保护下用封口膜密封烧瓶；于50 ℃恒温水浴锅内热引发聚合4 h后，再于60 ℃恒温水浴锅内热引发聚合20 h，得乳白色块状聚合物，将聚合物反复研磨，过200 目标准检验筛；用丙酮自然沉降3 次，弃去上层浊液，以除去聚合物中过细小的粒子；将沉淀物真空干燥后，以甲醇-乙酸（9∶1，V/V）为洗脱液进行索氏提取，直至索氏提取器内溶液不含LM为止；再用甲醇反复洗涤聚合物以去除乙酸，将处理好的MIPs放置于真空干燥箱内，40 ℃干燥至恒质量，待用。各条件下制备NTCZB的MIPs记为MIPs l～MIPs 16（表1）。作为对照，实验制备了空白印迹聚合物（non-imprinting polymers，NIPs），其制备方法与MIPs的步骤相同，只是在聚合过程中不加入LM[15]，对应样品记为NIPs l～NIPs 16。

表1 聚合物的制备条件Table 1 Conditions for preparation of polymers

1.3.4 NTCZB高效液相色谱检测条件及标准曲线[16]的绘制

高效液相色谱检测条件：色谱柱-Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇-水（60∶40，V/V），流速1 mL/min，保留时间15 min，进样量10 μL，柱温40 ℃，紫外检测波长254 nm。配制0.01～0.4 mg/mL的NTCZB标准溶液，高效液相色谱检测该系列标准溶液，以3 次检测结果中目标峰的平均峰面积（y）对质量浓度（x）绘制标准曲线，NTCZB标准曲线的线性回归方程：y=17 765x＋125（R2=0.999）。

1.3.5 MIPs的静态吸附实验

称取50 mg MIPs，置于20 mL具塞锥形瓶中，加入8 mL的一定质量浓度的NTCZB-氯仿溶液，于振荡器上25 ℃、150 r/min振荡12 h后，倒入10 mL离心管中6 000 r/min离心5 min，移取适量上层清液，微孔滤膜过滤后，高效液相色谱检测NTCZB浓度，差减法计算该聚合物对NTCZB的吸附量[17]，计算见式（1）：

式中：Q为MIPs的吸附量/（mg/g）；C1为氯仿溶液中NTCZB的原始质量浓度/（μg/mL），C0为吸附后上层清液中NTCZB的质量浓度/（μg/mL）；V为所用氯仿溶液的体积/mL；m为印迹聚合物的质量/g。

分子印迹研究中通常用特异因子α表示印迹效果。特异结合量和特异因子分别定义为式（2）、（3）：

式中：ΔQ为特异结合量/（mg/g）；QMIPs为MIPs的吸附量/（mg/g）；QNIPs为NIPs的吸附量/（mg/g）；α为特异因子。

1.3.6 MIPs的红外表征[18]

称取MIPs和NIPs各10 mg，1 000 mg溴化钾，研磨充分后于100 ℃烘干至恒质量，经压片后，在傅里叶变换红外光谱仪上进行测定（扫描范围400～4 000 cm-1）。

1.3.7 MIPs对花椒中NTCZB的分子印迹验证实验

取1.0 g粉碎后的花椒粉末置于75 mL氯仿中，于35 ℃、150 r/min振荡提取12 h，再将其转移到分液漏斗中，振摇2 min，静置分层后，收集氯仿萃取液，定容于100 mL容量瓶中。称取250 mg MIPs，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入30 mL的上述萃取液，于振荡器上25 ℃、150 r/min振荡5 h后，转入10 mL离心管中6 000 r/min离心5 min，收集固体沉淀物，以甲醇为洗脱液对固体沉淀物索氏抽提24 h，将洗脱液浓缩至100 mL，高效液相色谱检测洗脱液中NTCZB的含量[19]。

1.4 数据处理

每组实验重复3 次，用Origin 8.0和Excel 2003处理实验数据并作图，结果以 ±s表示。

2 结果与分析

2.1 单体与LM的紫外光谱分析

根据吸光度加和性，若溶液中各个组分彼此间不发生作用，则吸光度就等于该溶液中各个组分的吸光度之和，即混合物的理论吸光度，而该混合物的实际吸光度为该混合物溶液在该波长下实测的紫外吸光度，理论吸光度与实际测量值差值越大，表明二者相互作用也越大。

图2 LM、功能单体及其混合物的紫外吸收光谱Fig. 2 Ultraviolet absorption spectra of LM, functional monomer and their mixture

从图2可以看出，所有样品的理论吸光度（E1）均大于实际测量值（E2），说明LM与功能单体间发生了相互作用，原因是LM上存在酰基和羟基，与功能单体形成氢键[20]。LM-MAA在波长200 nm处的实测值与理论值差值为0.937±0.095，LM-AM波长200 nm处的实测值与理论值差值为0.977±0.101，LM-2-Vpy波长200 nm处的实测值与理论值差值为1.248±0.138，从差值上可以看出LM与2-Vpy相互作用最大，理论上说，用2-Vpy为功能单体合成的MIPs具有更好的稳定性和特异性识别能力[21]。

由图3A、B、C可知，随着加入功能单体量的增加，LM和功能单体混合体系的最大吸收峰的吸光度呈上升趋势，这是因为LM上的—NH—、C=O和—OH基团与3 种功能单体上含有的助色团和生色团相连，产生电子跃迁，使混合体系的最大吸收峰的吸光度增加，同时使最大吸收峰向长波长方向移动，这说明随着功能单体的加入，LM与相应的功能单体通过氢键生成了新的复合物，而该复合物的稳定性直接影响MIPs的吸附效果[22]。吸光度变化趋于平缓时，说明混合物体系趋于稳定，此时进入平缓区的转折点所对应的混合物比例是最佳的配比[23]，从图3D可看出，LM与MAA、AM、2-Vpy在对应物质的量比在1∶4之后吸光度变化均较之前更加平缓，可推断LM与功能单体物质的量比为1∶4可能是聚合的较佳比例。

图3 不同比例功能单体对预组装体系紫外光谱的影响Fig. 3 Effect of different ratios between functional monomers on UV spectrum of preassembled system

差示紫外光谱扫描与不同物质的量比的功能单体加入量的紫外光谱扫描实验方法类似，仅将参比溶液换成相同浓度的LM溶液。LM与2-Vpy相互作用最大，故选择LM-2-Vpy组装体系进行差示紫外光谱分析，由于功能单体2-Vpy与LM以及其主客体复合物最大吸收波长在206 nm波长处，参照文献[24]，LM与功能单体反应公式可以推导整理为式（4）：

式中：n为LM和功能单体2-Vpy的结合比例（n=1，2，3，…）；b0为2-Vpy的浓度；a0为LM的浓度；ΔA为LM与LM-2-Vpy混合物的紫外吸光度差值；K为反应平衡常数。Δε为复合物与功能单体的摩尔吸光系数差值；Ι为比色皿厚度。

以ΔA/bn0对ΔA作图，可以推导出n值，从而得知在乙腈溶液中LM与功能单体的作用模式，进而揭示分子印迹作用机理。以ΔA/bn0对ΔA作图发现，物质的量比为1∶1、1∶2时并没有出现很好的线性关系，这是由于推导反应公式的假设条件为b0远大于a0，即功能单体加入量远大于LM，这2 种浓度并不满足上述假设条件。因此作线性关系图时舍弃这2 种比例。

从图4可以看出，当n为3时，ΔA/bn0对ΔA作图可以拟合成一条直线（R2=0.963）；当n为4时，ΔA/bn0对ΔA作图也可以拟合成一条直线（R2=0.974），这说明在研究的浓度范围内主客体主要存在形式为1 个LM与3 个或者4 个2-Vpy分子发生作用，即1 个LM周围至少需要3 个2-Vpy功能单体才能形成稳定的复合物[25]。

图4 206 nm波长处ΔA/bn0对ΔA的关系图Fig. 4 Plots of ΔA/bn0 versus ΔA at 206 nm

2.2 不同制备条件对MIPs的分子印迹效果的影响

由表2可知，MIPs 1、MIPs 2、MIPs 3对NTCZB的吸附量的大小关系为MIPs 3＞MIPs 2＞MIPs l，其特异性吸附效果也呈此趋势，即α3＞α2＞α1。说明以2-Vpy为功能单体时，MIPs 3对NTCZB的印迹效果最好，这与功能单体和LM的紫外光谱分析的结果吻合。

MIPs 3～MIPs 7对NTCZB的吸附量的大小为MIPs 7＞MIPs 6＞MIPs 3＞MIPs 5＞MIPs 4，其特异性吸附效果为α3＞α5＞α6＞α4＞α7，说明替代模板与2-Vpy物质的量比为1∶4时MIPs的印迹效果最好，这与紫外光谱分析研究LM和功能单体相互作用的结果吻合。

MIPs 8～MIPs 11和MIPs 3对NTCZB的吸附量的大小关系为MIPs 9＞MIPs 3＞MIPs 10＞MIPs 11＞MIPs 8，其特异性吸附效果为α9＞α3＞α8＞α10＞α11，随着交联剂用量增大，吸附量先增大而后减少，非特异性吸附一直增大，这是因为交联剂过量时，易发生自聚，使所得聚合物内的非特异性吸附位点增多，从而造成非特异性吸附量增大[26]，因此实验选择功能单体和交联剂物质的量比为2-Vpy与EDMA 4∶20。

MIPs 9、MIPs 12和MIPs 13的实验结果显示，MIPs 9对NTCZB的吸附量和特异性吸附效果最好，这是由于溶剂用量较小时，溶液中各组分浓度较大，这会使功能单体复合物被网络包裹的程度过于致密，致孔剂不能充分进入聚合物网络形成大孔结构；溶剂的用量较大时，反应溶液浓度较低，自由基引发聚合反应速度减慢，延长了聚合反应的时间[17]。MIPs 9、MIPs 14和MIPs 15的结果表明，其他条件相同时，温度A条件下制备的MIPs 9对NTCZB的印迹效果最好。

MIPs 9、MIPs 16对NTCZB的吸附量的大小关系为MIPs 9＞MIPs 16，其特异因子α也呈此趋势，即MIPs 9的印迹效果优于MIPs 16，这是因为聚合反应制备MIPs的过程中，NTCZB上的碳碳双键容易与交联剂发生共价键化学反应而形成大分子结构，使NTCZB没有被洗脱完全，从而造成NTCZB的再吸附时印迹孔穴的浪费和印迹位点利用率不高[9]。

综上所述，MIPs 9样品的分子印迹效果最好，在上述条件下对制备MIPs 9进行红外表征和吸附性能实验研究。

表2 不同制备条件的MIPs的分子印迹效果Table 2 Imprinting effect of MIPs prepared under different conditions

2.3 MIPs 9对NTCZB印迹前后的红外光谱分析

由图5可知，3 条曲线的出峰位置很相近，但仍存在很多差异，洗脱前MIPs 9、洗脱后MIPs 9、NIPs 9在2 965 cm-1附近的双峰是功能单体2-Vpy中吡啶环上的C—H伸缩振动峰，洗脱前MIPs 9在此处的峰形明显区别于洗脱后MIPs 9和NIPs 9，这是因为LM上的酰基与2-Vpy发生相互作用，形成氢键而缔合于MIPs上，洗脱前MIPs 9在1 540 cm-1处和1 635 cm-1处比洗脱后MIPs 9和NIPs 9的强度弱，这主要是LM上的仲酰胺N—H和C=O反式存在的吸收峰产生[27]，洗脱前MIPs 9在2 853 cm-1处的峰是LM上的饱和C—H伸缩振动，洗脱前MIPs 9与洗脱后MIPs 9、NIPs 9的这些差异说明LM已经通过氢键结合在了MIPs上[28]；洗脱后MIPs 9和NIPs 9几乎没有差别，这说明LM已经完全被洗脱下来[29-30]。

图5 MIPs 9和NIPs 9的红外光谱图Fig. 5 IR spectra of non-imprinted polymers and molecularly imprinted polymers

2.4 MIPs 9对花椒中NTCZB的分子印迹验证实验结果

图6 花椒萃取液、甲醇洗脱液及NTCZB标准品的高效液相色谱图Fig. 6 HPLC profiles of the extract of prickly ash, the methanol eluate and NTCZB standard

由图6可知，甲醇洗脱液与NTCZB标准品的峰形及出峰时间一致，可确证分离纯化出的物质主要成分是NTCZB；花椒萃取液中NTCZB的峰面积占总峰面积的（72.65±1.27）%，MIPs 9的甲醇洗脱液中NTCZB占总峰面积的（94.60±1.52）%，NTCZB占总峰面积的比例提高了约21.95%；同时，高效液相色谱检测到浓缩的甲醇洗脱液中NTCZB质量浓度为（34.2±3.1）μg/mL，经计算MIPs 9对花椒的氯仿萃取液中NTCZB的吸附量为（14.64±0.80）mg/g。结果表明，MIPs 9对花椒萃取液中的NTCZB有较强的特异性吸附能力[31]。

3 结 论

取LM 0.25 mmol，以2-Vpy为功能单体，LM、功能单体、交联剂物质的量比为1∶4∶20，乙腈12 mL，AIBN 10 mg，在50 ℃恒温水浴聚合4 h后再在60 ℃恒温水浴聚合20 h，该条件下合成的MIPs对NTCZB具有较好的特异性吸附效果；在该条件下制备的MIPs可以吸附花椒萃取液中的NTCZB，吸附量达到（14.64±0.80）mg/g。实验结果表明：分子印迹技术可以应用于NTCZB标准品的分离纯化。采用LM能够制备出对NTCZB具有较强印迹效果的MIPs。本研究为具有该分子结构特点物质的MIPs的制备提供了方法借鉴，同时也对NTCZB的研究和应用具有借鉴价值。