高效液相色谱法检测活性食品包装薄膜中的香芹酚和百里香酚

杨春香，王易芬，王 婧*，李 立，文艺桦，杨秉浩

香芹酚（carvacrol，Cal）和百里香酚（thymol，Tml）是2种同分异构体的单萜酚类物质，具有较强的抗菌谱。Cal及Tml普遍存在于唇形科植物及植物的精油中，如牛至精油、百里香挥发油和香薄荷属等[1-2]。研究表明，Cal和Tml具有较强的生物活性，如抗氧化、抗菌等特性，可被用作食品添加剂、防腐剂等[3-7]。和食品添加剂加入到食物中相比，通过直接或间接的方式将抗菌抗氧化活性物质与聚合物材质进行熔融共混，制备出的活性包装薄膜不仅可以延长食品的货架期[8-9]，同时也保证了消费者的饮食安全，并限制了因加入添加剂而造成食物不良风味的产生[10]。目前，关于聚合材质如聚丙烯、聚乙烯和乙烯-乙烯醇共聚物中添加植物精油的有效性及抗菌活性的研究越来越多[11-14]。Persico等[8]以有机改性的蒙脱土作为填充剂，Cal为活性物质与低密度聚乙烯树脂基材（low density polyethylene，LDPE）进行共混改性制备出抗菌纳米包装薄膜，研究了改性LDPE薄膜的物理机械性能和抗菌性能。但该工作没有对其抗菌的主要方式——活性物质的迁移进行研究。

由于全球环境问题的日趋严峻，研究者们开始将食品包装的重心逐渐转移到可生物降解的塑料材料和绿色包装上来[15-18]。聚乳酸（polylactic acid，PLA）是以乳酸为主要原料聚合得到的聚合物，原料来源充分且可再生，且生产过程无污染，并通过生物降解实现在自然界中的循环，是理想的绿色高分子材料[19-22]。本实验以丁二酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物（poly(butylene succinate adipate)，PBSA）为改性剂[23-25]，Cal和Tml为活性物质加入到PLA基材中，通过熔融共混，流延制备出改性PLA食品活性包装薄膜。该薄膜具有一定的抗菌抗氧化性能，可延长食品的货架寿命。其作用机理主要是通过薄膜中活性物质扩散到包装袋的内环境中，或迁移到经包装的食品表面来抑制微生物的滋生及脂质的氧化腐败[26]，最终保证食品的品质并达到延长保质期的目的。

目前有关检测食品包装薄膜中Cal和Tml的国家标准、行业标准尚未推出。此外，关于食品包装薄膜及薄膜中活性成分的化学分析文献和迁移检测方法文献也比较缺乏。杨希国[27]、吉力[28]等分别建立了高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定饲料、香薷中Cal和Tml的含量；董茂峰等[29]采用气相色谱法测定饲料中Cal和Tml的含量，但检测食品包装薄膜中活性成分Cal和Tml的方法鲜见报道。为探讨食品包装薄膜中活性物质的迁移机理及迁移规律，本实验建立基于HPLC法测定改性PLA包装薄膜中Cal和Tml含量的方法。HPLC法测定薄膜中活性物质的含量，具有操作简单、分析时间短、精确度高等优点，不仅为食品包装薄膜中Cal、Tml和相关酚类的迁移检测及应用提供了依据，并为进一步研究同类型活性包装薄膜的迁移规律及包装食品的保鲜效果提供有效的分析检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

PLA 东莞市粤发塑胶原料有限公司；PBSA昭和电工株式会社；Cal（纯度99%）、Tml（纯度98%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；实验用水为Milli-Q超纯水；乙酸、无水乙醇（均为分析纯），乙腈（HPLC级） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

XSS-300转矩流变仪、LSSL-20双螺杆挤出机、LYJ-流延机装置 上海科创橡塑机械设备有限公司；1260型HPLC仪 安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品薄膜的制备

实验设计制备出2 种不同的样品薄膜：空白样品：PLA＋PBSA；样品：PLA＋PBSA＋质量分数4% Cal＋质量分数4% Tml。

薄膜样品制备流程：PLA树脂＋PBSA树脂＋活性物质→双螺杆挤出、共混改性造粒→改性母粒→流延机流延膜→改性PLA活性包装薄膜。样品薄膜制备完后，装入铝箔自封袋内并做好编号标记，密封避光保存备用。

1.3.2 样品检测液的制备

参照Lopez等[30]的方法，将样品薄膜浸泡于四类食品模拟液中，检测Cal和Tml的迁移率。纯水模拟含水较多的食品、3%乙酸溶液模拟酸性食品、10%乙醇溶液模拟含酒精的食品、95%乙醇溶液模拟脂类食品。同时测定样品薄膜浸泡于流动相溶液中时Cal和Tml的迁移率。

样品薄膜按6 dm2/L（约1.00 g）裁剪碎后分别置于250 mL锥形瓶，铝箔覆盖避光。

1.3.3 样品检测液的提取

样品薄膜在浸泡24 h和浸泡96 h后分别取样，取样前振荡摇匀锥形瓶，取样时，用相应模拟液溶液3 倍稀释，提取液经0.22 µm微孔滤膜过滤至样品瓶，贮存于4 ℃冰箱内，待检测。

1.3.4 标准溶液的配制

准确称取Cal和Tml标准品各0.050 0 g，分别置于50 mL棕色容量瓶中，乙腈定容，配制成1 000 mg/L的标准储备溶液，-20 ℃保存备用。临用时，用乙腈稀释上述标准储备溶液，配制成不同质量浓度的标准工作液。

1.3.5 色谱条件

色谱柱：Sunfire C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流动相：乙腈-水（3∶2，V/V）；色谱柱温（30±5）℃；流速1 mL/min；等梯度洗脱；进样量10 μL；检测波长274 nm；分析时间10 min；检测器为紫外检测器。

2 结果与分析

2.1 线性关系、检出限及定量限测定结果

表1 Cal和Tml的标准曲线方程及相关系数Table 1 Regression equations, limits of detection and limits of quantification for Cal and Tml

图1 20 mg/L Cal和Tml标准品的HPLC图Fig. 1 HPLC chromatogram of mixture of 20 mg/L Cal and Tml standard

将配制的5、10、20、50、100 mg/L标准工作液，在1.3.5节色谱条件下进行测定及回归分析。由表1、图1可知，在5～100 mg/L的范围内，Cal和Tml的线性关系良好。

2.2 样品薄膜加标回收率实验结果

表2 平均回收率与RSD（n=6）Table 2 Recoveries of spiked samples and relative standard deviations(RSD) (n = 6)

将空白样品薄膜按6 dm2/L（约1.00 g）浸泡于4 种食品模拟液及流动相溶液中，分别向浸泡液中添加不同质量浓度的Cal和Tml标准溶液，进行加标回收实验[31]。由表2可知，在低、中、高的添加水平范围内，Cal平均回收率为71.6%～93.7%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为5.2%～8.3%，Tml平均回收率为73.1%～103.6%，RSD为5.0%～8.8%。由表2可知，Cal和Tml标准品在水、3%乙酸溶液及10%乙醇溶液中的加标回收效果不佳，在95%乙醇溶液和乙腈-水（3∶2，V/V）溶液中的回收效果相接近，这说明本实验色谱检测条件较佳。因此，分析实际样品时选用乙腈-水（3∶2，V/V）溶液进行模拟迁移。

2.3 自制活性薄膜样品的检测结果

表3 薄膜中活性物质检出回收率Table 3 Migration rates of Cal and Tml from films

图2 乙腈-水（3∶2，V/V）溶液中Cal和Tml的色谱图Fig. 2 HPLC chromatogram of Cal and Tml with mobile phase consisting of acetonitrile and water (3:2, V/V)

由表3可知，改性PLA活性包装薄膜中的活性物质在乙腈-水（3∶2，V/V）溶液中浸泡24 h，96 h后的检出回收率差异不大；薄膜浸泡24 h后，活性物质几乎完全溶出，且Cal的检出回收率达95%，Tml的检出回收率达97.5%；浸泡96 h后，Cal和Tml的检出回收率均达97.5%。这表明添加有质量分数4% Cal＋4% Tml的改性PLA活性包装薄膜浸泡于模拟液在早期阶段便可较好地迁移出活性物质Cal和Tml。同时，在95%乙醇溶液和乙腈-水（3∶2，V/V）溶液中的回收效果相接近，而95%乙醇溶液通常被用来模拟脂类食品，因此该薄膜可能更适用于包装脂类含量较高的食品。图2显示，薄膜在乙腈-水（3∶2，V/V）溶液中迁移出的Cal和Tml出峰情况较佳，峰强度高，定量精确度高。这表明实验选用的HPLC检测条件较佳，可有效洗脱出样品。

3 结 论

本实验建立HPLC测定改性PLA活性包装薄膜中活性物质Cal和Tml含量的方法。目前活性包装薄膜中物质迁移的相关检测方法较少，主要原因是活性包装薄膜制备工艺较复杂，本实验使用的样品薄膜均为自制。本方法最终选用乙腈-水（3∶2，V/V）溶液为提取液，浸泡96 h后，薄膜中Cal和Tml的检出回收率均达97.5%。

本方法具有操作简单、分析时间短、精确度高等优点，不仅为食品包装薄膜中Cal、Tml和相关酚类的迁移检测及应用提供了依据，并为进一步研究同类型活性包装薄膜的迁移规律及包装食品的保鲜效果提供有效的分析检测方法。