不同鸡品种BLEC1基因序列比较分析

张 莘，常国斌，郑圣晗，王统苗，陈博雯，张 扬，王志秀，陈国宏

(扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009)

鸡主要组织相容性复合体(MHC，Major histocompatibility complex)与机体多种疾病抗性和免疫系统关系密切[1-2]。BLEC1基因(C-type lectin-like receptor 1)位于鸡MHC核心区域，编码C型凝集素区域[3]，与CD69家族的激活抗原相关，最接近于人LLT1基因和小鼠Clr基因家族[4]，BLEC1基因RNA有广泛的组织分布，并且脾细胞激活后显著上调[5]。C型凝集素是免疫应答中具有多种功能的蛋白质[6-7]，BLEC1氨基酸序列与C型凝集素第Ⅴ组的受体有很大的同源性，C型凝集素第Ⅴ组的受体包括C型凝集素类似NK受体，许多C型凝集素类似NK受体能结合MHC Ⅰ类分子[3，8]，所以，BLEC1基因对于先天性免疫和抗病性有重要作用。有文献报道，鸡MHC具有1对凝集素样受体基因，一个是NK受体，另一个是激活抗原，与人类和小鼠基因组的NK复合体(NKC)转录方向相反[5，9]。Bernot等[10]发现，类似MHC区域的Rfp-Y区域有许多凝集素类似物基因，且其中有几个基因与BLEC1基因类似[11]，但是通过对鸡的基因组序列分析，研究人员并没有发现与BLEC1基因类似的基因[12]，BLEC1基因与鸡抗病性的关系还不明晰。目前，国内外针对BLEC1基因的研究相对较少，而BLEC1基因在鸡上的研究对其抗病育种有重要意义，同时鸡肉又是我国的重要肉源之一。

本研究通过目标捕获测序，筛选出BLEC1基因的Indels、SNPs位点以及对应氨基酸的变化，为了探究该基因在不同鸡品种中的遗传多样性，对该基因进行系统聚类比对分析，希望可以为家禽抗病育种和免疫遗传学提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究使用的26个鸡品种分别是：红色原鸡(RJ)亚种、如皋鸡(RC)、茶花鸡(CH)、安卡鸡(AK)、藏鸡(ZC)、AA鸡(AA)、白耳鸡(BE)、仙居鸡(XJ)、罗斯鸡(RS)、绿壳蛋鸡(GC)、SPF-来航鸡(LH)、太湖鸡(TH)、斗鸡(DJ)、萧山鸡(XC)、溧阳鸡(LC)、北京油鸡(BY)、鹿苑鸡(LY)、固始鸡(GS)、雪山草鸡(XS)、黑狼山鸡(HL)、泰和乌骨鸡(WG)、大骨鸡(BB)、青脚麻鸡(QJ)、文昌鸡(WC)、广西黄鸡(GH)、隐性白羽鸡(RW)26个鸡品种中红色原鸡(RJ)亚种来自云南省野生动物救护中心，仙居鸡(XJ)、茶花鸡(CH)、北京油鸡(BY)、鹿苑鸡(LY)、萧山鸡(XC)、白耳鸡(BE)、泰和乌骨鸡(WG)、藏鸡(ZC)、黑狼山鸡(HL)、固始鸡(GS)、斗鸡(DJ)、大骨鸡(BB)12个地方鸡品种来自中国农业科学研究院家禽科学研究所国家地方禽种资源基因库，其余鸡品种均来自扬州大学动物科学与技术学院遗传资源实验室禽种资源基因库。

1.2 DNA提取

每个鸡品种翅静脉采血1 mL，置于2 mL离心管中，离心管中盛有0.1 mL的肝素钠抗凝剂，共收集10个样本，用苯酚和氯仿法提取DNA，选择完整性好(无拖尾现象)，OD值介于1.8～2.0的DNA样品稀释至50 ng/μL，4 ℃冷藏保存。

1.3 BLEC1基因序列分析与进化树构建

将DNA样品送深圳华大基因公司进行目标序列捕获测序，获得序列以NCBI(National Center of Biotechnology Information)中红色原鸡(Gallusgallus)为标准基因库，并用MEGA 6软件对26个鸡种BLEC1基因序列进行对比分析，筛选BLEC1基因的SNPs位点和Indels位点，最后运用邻接法(Neighbour joining)系统聚类分析26个鸡品种构建进化树(Phylogenetic tree)。

2 结果与分析

2.1 BLEC1基因序列分析

为了探究我国地方鸡种BLEC1基因中碱基序列，笔者查询了NCBI中红色原鸡的碱基，并以此为参考序列，序列号为NC_006103.4。由图1可知，红色原鸡的BLEC1基因位点118 439-122 492，共4 054 bp，外显子5个，内含子4个。通过对比可知(表1)，在26个鸡品种中BLEC1基因内含子上有59个Indels位点和45个SNPs位点，外显子上有53个Indels位点和16个SNPs位点，由此可见BLEC1基因有较好的多态性。

2.2 不同鸡品种中BLEC1基因SNPs位点统计分析

鸡种测序所得的SNPs如表2所示，共发现14个SNPs，主要位于Exon1、Exon2、Exon5和内含子上，其中有5个SNPs位于外显子上，其余SNPs均位于内含子中。且在外显子中氨基酸有3个发生错义突变，其余为同义突变。

图1 NCBI中红色原鸡 BLEC1基因序列Fig.1 BLEC1 gene sequences in Gallus gallus

表1 BLEC1基因外显子和内含子上SNPs和Indels分布情况Tab.1 Nucleotide variations in exons and introns of BLEC1 gene

表2 BLEC 1基因SNPs、氨基酸信息Tab.2 SNPs and amino acid information of BLEC 1 gene

表3显示了各鸡种BLEC1基因SNPs的分布情况，对BLEC1外显子SNPs进行分析发现，SNP5存在于泰和乌骨鸡、SPF-来航鸡、北京油鸡、太湖鸡、红色原鸡亚种、青脚麻鸡和鹿苑鸡中，SNP1和SNP2只在雪山草鸡和鹿苑鸡中检测到，安卡鸡、SPF-来航鸡和泰和乌骨鸡的突变位点一致为SNP3，鹿苑鸡和SPF-来航鸡有3个SNPs位点，雪山草鸡和泰和乌骨鸡有2个SNPs位点，Exon2上的SNP4位点只在萧山鸡和SPF-来航鸡中发现，国外鸡品种中AA鸡、罗斯鸡和隐性白羽鸡均没有发现SNPs位点。随后，笔者对该基因内含子进行分析，SNP10在固始鸡、如皋鸡、藏鸡等10个鸡品种中检测到，萧山鸡、绿壳蛋鸡、太湖鸡等17个鸡品种含有SNP14，SPF-来航鸡内含子上有6个SNPs位点，在所有鸡品种中最多，萧山鸡、安卡鸡、SPF-来航鸡和泰和乌骨鸡的突变位点大体一致。其他鸡品种，包括国外鸡品种如罗斯鸡和AA鸡均没有检测到SNPs位点。鹿苑鸡、萧山鸡、SPF-来航鸡等鸡种在外显子的SNPs位点较多，且导致了氨基酸变化，抗性较好的鸡种SNPs普遍多于抗性差的鸡种，表明BLEC1基因的SNPs位点与鸡种的抗病力密切相关。

2.3 不同鸡品种中BLEC1基因Indels位点统计分析

在不同鸡品种BLEC1基因的Indels分布中，BLEC1基因的插入缺失发生在Exon1和内含子中(表4)，12处插入缺失中有3处发生在外显子上，且在鸡种中广泛存在(表5)，除黑狼山鸡外，其余鸡品种中均存在Indel1位点，同时Indel3存在于除雪山草鸡和鹿苑鸡外的所有鸡种中，这些都导致BLEC1基因Exon1翻译产物发生巨大的变化，而且在BLEC1内含子上，除萧山鸡外，其余鸡品种都筛选出Indels位点，这些都表示BLEC1基因具有极高的多态性。

表3 不同鸡品种 BLEC 1基因的SNPs分布情况Tab.3 SNPs distribution of BLEC 1 gene in different breeds

注：“+”表示存在；空白表示不存在。表5同。
Note：“+”Indicates existence;Blank indicates no existence.The same as Tab.5.

表4 BLEC 1基因Indels信息Tab.4 Indels information of BLEC gene

注：D和I分别代表碱基缺失和插入；“/”后面表示缺失或插入的序列。
Note：D and I represent base deletions and insertions，respectively； “/” after that are the sequence of deletions and insertions.

表5 不同鸡品种BLEC 1基因的Indels分布情况Tab.5 Indels distribution of BLEC 1 gene in different breeds

2.4 不同鸡品种中BLEC1基因系统聚类分析

将不同鸡品种的BLEC1基因用MEGA 6软件运用邻接法构建NJ(Neighbour-joining)进化树，如图2所示，树枝的长度代表了树的距离，树枝上显示Bootstrap 1 000个循环设置的置信度。由图2可知，26个鸡品种大致分为3类，其中，安卡鸡、SPF-来航鸡和泰和乌骨鸡聚为一类；萧山鸡单独为一类；其余鸡种聚为一类。我国地方鸡品种中，BLEC1基因具有丰富的遗传多样性，不同鸡品种的抗病性和免疫能力可能存在差异。

图2 不同鸡种NJ系统进化树(Bootstrap=1000)Fig.2 NJ phylogenetic tree of differentbreeds(Bootstrap = 1000)

3 讨论

BLEC1基因是迄今为止描述的任何非哺乳动物C型凝集素与特定哺乳动物NKC编码受体序列同一性最接近的基因，且BLEC1基因和BNK基因与特定的哺乳动物NKC编码受体的相关性比其他鸡C型凝集素更密切[5]，在迄今为止研究的任何哺乳动物的MHC中没有鉴定到C型凝集素基因，表明BLEC1基因可能与鸡的先天免疫性能有一定的关联。本研究结果表明，在BLEC1基因的5个外显子中，SNPs主要存在于Exon1、Exon2、Exon5，Exon3和Exon4没有碱基突变，同时5个存在于外显子的SNPs位点中有3个导致氨基酸发生错义突变，可能导致单元型之间的功能能力差异以支持免疫影响疾病易感性的反应，这与Shiina等[12]的研究结果一致。宁官保等[13]研究表明，BLEC1基因的表达与鸡马立克病(MD)耐受性有着密切的关系，又有研究表明，我国许多地方家禽品种拥有较强的抗病性状和免疫能力，且对马立克氏病的抗性较高[14]，本研究中，SNPs位点基本集中在鹿苑鸡、雪山草鸡、SPF-来航鸡等抗病性强的鸡种上，所以，这些SNPs位点可能与鸡的抗病性有关。国外鸡品种中AA鸡和罗斯鸡不存在任何突变位点，这可能与其为国外鸡种起源不同且抗病性差有关。同时在Exon1上存在多个插入缺失位点，表明BLEC1基因多态性主要集中于Exon1，Indel1存在于除黑狼山鸡以外的所有鸡种中，所以，Indel1可以作为鸡免疫特性的候选标记。基因中内含子并不参与蛋白质的编码，但是有研究表明，内含子对蛋白质的调控和编码序列有重要作用[15-17]。26个鸡品种中BLEC1基因的内含子上有45个SNPs位点和59个Indels位点，可能与该基因的表达调控有关。以上这些都显示出BLEC1基因具有较高的多态性，可能和鸡的抗病性有关。

有研究报道，中国地方鸡种的杂合度值明显高于其他蛋鸡、肉鸡等商业品系及欧洲地区的部分地方鸡种[18-20]。从NJ进化树中可以看出，安卡鸡、SPF-来航鸡和泰和乌骨鸡聚为一类，在这3个鸡种都含有SNP3和SNP9，且这2个位点不存在于其他鸡种中；萧山鸡自成一类可能是因为其在1999年被确认灭绝[21]，且在本试验中只有萧山鸡未筛选出Indels位点，所以BLEC1基因上的Indels位点影响了基因的表达调控；在剩余鸡种中，鹿苑鸡和青脚麻鸡有极高的同源性，这2种鸡都具有适应性广、抗病性强的特性，所以聚类在一起，在陈颖等[22]的研究结果中，茶花鸡、藏鸡、仙居鸡、白耳鸡聚在一类，这与本研究结果相同。我国地方鸡品种BLEC1基因具有遗传多样性，且与鸡种的抗病性有关，但是鸡BLEC1基因与疾病间具体的关联机制还需进一步研究探讨。