c-Myc调控长链非编码RNA7对舌鳞癌细胞增殖的影响

徐艳雪，韩曈曈，朱友明，陈乔尔

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类不具有蛋白编码功能的RNA分子，其转录物长度大于200个核苷酸。研究显示，lncRNA是胚胎发生[1]、干细胞生物学和细胞发育[2]及癌症进展[3]中至关重要的调节因子。c-Myc是一种较早被证实的癌基因，能与一些蛋白编码或非编码RNA的启动子调节区域结合，促进细胞分裂，使细胞永生化，在多种人类肿瘤的检测中都能发现其表达升高。因此，为了在舌鳞癌中识别参与c-Myc功能调控的lncRNAs，该研究使用携带c-Myc tet-off系统的SCC3舌鳞癌细胞进行基因芯片分析。经过初步筛选，发现敲低c-Myc表达水平，一种新基因lncRNA7(lncRNA-RP11-132A1.4，位于chr7:100,951,626-100,954,266，序列名称ENST00000419422)的表达显著下调。该实验旨在探究敲低受c-Myc调控的lncRNA7后，观察舌鳞癌细胞SCC3增殖的变化，从而为舌鳞癌的分子靶向治疗提供新契机。

1 材料与方法

1.1主要材料及试剂人源SCC3舌鳞癌细胞和人源293T胚胎肾细胞均为安徽医科大学口腔实验室保种；DMEM培养液、青链霉素溶液、胎牛血清、PBS、胰酶溶液购自GIBCO公司和Hyclone公司；大肠杆菌DH5α为本实验室传代保存；1%氯化钠、1%蛋白胨、0.5%酵母提取物购自上海生工生物工程股份有限公司；慢病毒包装试剂购自上海和元技术有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；actin抗体、c-Myc抗体购自美国Santa Cruz公司；RNA提取试剂盒购自美国Promega公司，逆转录试剂盒、QRT反应试剂盒购自日本TaKaRa公司，质粒提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒购自美国Axygen公司，蛋白质定量试剂盒购自美国Thermo公司，MTT试剂购自美国Sigma公司，DEPC无酶水，DMSO试剂购自上海碧云天科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将SCC3细胞和293T细胞分别培养在含有10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM溶液中，并置于37 ℃、5% CO2培养箱中。隔天换液，依据细胞生长情况适时进行传代及冻存，后续实验备用。

1.2.2载体构建 下调c-Myc表达的pLKO.1-shc-Myc组及pLKO.1-shc-cMyc-ctrl对照组、上调c-Myc表达的Flag-c-Myc组及Flag对照组载体均由中国科学技术大学生命科学院提供。shlncRNA7载体引物由上海生工技术服务有限公司设计和合成，扩增得到目的片段shlncRNA7 F：5′-CCGGGGAAAGGG AAGAAGTCCTCCTCGAGGAGGACTTCTTCCCTTTCC TTTTTG-3′，R：5′-AATTCAAAAAGGAAAGGGAAGAA GTCCTCCTCGAGGAGGACTTCTTCCCTTTC-C-3′。将上述扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离、纯化产物，回收目的片段。限制性内切酶酶切载体pLKO.1，T4连接酶在37 ℃水浴中将目的片段与载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α，涂于氨苄抗性的LB固体培养基平板上，37 ℃倒置培养14 h。选取阳性菌落送公司测序鉴定，证实构建成功。

1.2.3慢病毒包装与转染 根据实验需要，以上已构建好的携带pLKO.1-shc-Myc、Flag-c-Myc、pLKO.1-shlncRNA7的载体均需分别进行慢病毒包装与转染。病毒包装过程中将2 μg携带目的基因的载体以及3种包装辅助质粒包括2 μg pREV、2 μg pGag和1μg pVSVG共同转染入293T细胞(293T细胞在转染前先接种于6孔板中，待密度达到50%～60%时进行转染，转染前1 h更换新鲜培养基)，于不含血清的DMEM溶液中培养6 h，再更换为含有20%胎牛血清的DMEM溶液，收集48、72 h含有病毒的细胞上清液保存于-80 ℃中。转染SCC3细胞前一天胰蛋白酶消化细胞，取适量接种于6孔板中，密度15%左右，待第2天SCC3密度达30%左右再将以上收集到的含病毒的细胞上清液转入，每孔同时加入8 mg/L的Polybrene 2 μl。8 h后更换新鲜培养基，48 h后接种至6孔板,待细胞生长到密度大约70%时加入5 mg/L嘌呤霉素筛选，24 h后观察细胞凋亡情况；再吸取上清液，更换新的选择性培养液。在加药筛选2～3周情况下能存活的SCC3细胞即为转染成功的细胞，死亡的细胞即为未转染成功的细胞。对存活的细胞进行克隆和扩大培养，培养至适当规模时，收集该单克隆抗药细胞。

1.2.4Western blot检测c-Myc的蛋白表达 SCC3细胞分为pLKO.1-shc-Myc-ctrl对照组、pLKO.1-shc-Myc组、Flag对照组和Flag-c-Myc组。每组加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，分别收集裂解液至1.5 ml Ep管中。BCA法定量测样品的蛋白浓度，每组取等量的蛋白样品，SDS-PAGE电泳，转膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜，每组分别加入c-Myc抗体(货号CST9402，1 ∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜，TBST清洗3次，加入相应二抗室温孵育1.5 h，TBST再清洗3次，底物化学发光检测法显影。

1.2.5qRT-PCR检测lncRNA7的表达水平 用TRIzol分别提取稳定转染pLKO.1-shc-Myc组、pLKO.1-shc-Myc-ctrl对照组、Flag-c-Myc组、Flag对照组、pLKO.1-shlncRNA7组 及pLKO.1-shlncRNA7-ctrl对照组的SCC3细胞中的总RNA。利用PrimeScriptTMRT Master Mix 逆转录试剂盒获得cDNA，-20 ℃保存备用。LncRNA7引物F：5′-GGAAAGGGAAGAAGTCCTCCC-3′，R：5′-TCCACAATTCTCTA-TATGACA-3′。PCR反应条件：94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30个循环。以GAPDH作为分子内参，待反应完毕以ΔΔCt值来分析各组的结果。pLKO.1-shc-Myc-ctrl对照组SCC3细胞中lncRNA7表达量的均数设为1，计算出pLKO.1-shc-Myc组SCC3细胞中lncRNA7的相对表达量；Flag对照组SCC3细胞中lncRNA7表达量的均数为1，计算出Flag-c-Myc组SCC3细胞中lncRNA7的相对表达量；pLKO.1-shlncRNA7-ctrl对照组SCC3细胞中lncRNA7表达量的均数设为1，计算pLKO.1-shlncRNA7组SCC3细胞中lncRNA7的相对表达量。

1.2.6MTT实验检测SCC3细胞生长 将pLKO.1-shlncRNA7组和pLKO.1-shlncRNA7-ctrl对照组的SCC3细胞接种于96孔板，密度为2×103个/孔，在0、6、12、24、48、72 h的6个时间点弃原培养液，每孔加入5 g/L 的MTT 20 μl，37 ℃培养4 h，再弃培养液，每孔新加入150 μl的 DMSO，振荡10 min，酶标仪570 nm处测定各孔的吸光度(OD)值。

1.2.7细胞克隆实验检测SCC3细胞增殖 将pLKO.1-shlncRNA7组和pLKO.1-shlncRNA7-ctrl对照组SCC3细胞分别接种于6孔板，密度为300个/孔，培养10 d。4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色4 h，TBST清洗。

1.2.8荧光原位杂交技术检测lncRNA7的定位 将细胞标本放在含10%固定液(甲醇 ∶冰醋酸=3 ∶1)的1×PBS中5 min进行预变性。将玻片标本浸入固定液中2次，每次10 min，再将标本依次经体积分数为70%、90%和100%的冰乙醇，然后干燥。湿盒中倒入50%甲酰胺/2×SSC 50 ml，37 ℃预热。以地高辛标记DNA探针，序列为ACTCAATTCAAATATTTAATGGGTTGTACTCTGGCCATTCAGG-TGAACAAAATCTGCTGG，孵育探针，80 ℃变性10 min。变性好的样本于湿盒中37 ℃杂交过夜。次日，将已杂交的玻片标本置于42～50 ℃体积分数为50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5 min。2×SSC室温下清洗玻片标本。细胞核Hoechst染色1 min，2×SSC洗涤2次，指甲油封闭盖片，荧光显微镜下拍照。

2 结果

2.1不同表达载体转染SCC3细胞后c-Myc蛋白的表达将构建好的载体pLKO.1-shc-Myc组及其pLKO.1-shc-Myc-ctrl对照组转染入SCC3细胞，通过Western blot检测c-Myc蛋白表达情况。结果表明，与pLKO.1-shc-Myc-ctrl对照组相比，pLKO.1-shc-Myc组中c-Myc表达水平明显降低(P<0.05)；同样，将构建好的载体Flag-c-Myc及其Flag对照组转染入SCC3细胞，通过Western blot检测c-Myc蛋白表达情况。结果表明，与Flag对照组相比，Flag-c-Myc组中c-Myc表达水平明显升高(P<0.05)，见图1。

图1 c-Myc蛋白表达情况A:pLKO.1-shc-Myc组和pLKO.1-shc-Myc-ctrl对照组转染入SCC3细胞后细胞中c-Myc的蛋白表达；B：Flag-c-Myc组和Flag对照组转染入SCC3细胞后c-Myc的蛋白表达

2.2c-Myc表达水平对lncRNA7表达的影响利用qRT-PCR检测上述成功表达shc-Myc的SCC3细胞中lncRNA7的表达水平。结果表明，与pLKO.1-shc-Myc-ctrl对照组相比，pLKO.1-shc-Myc组lncRNA7的表达水平下降(F=132.589，P<0.05)；同样，利用qRT-PCR检测上述成功过表达c-Myc的SCC3细胞中lncRNA7的表达水平。结果表明，与Flag对照组相比，Flag-c-Myc组lncRNA7的表达水平上升(F=602.91，P<0.05)，见图2。提示在舌鳞癌细胞SCC3中lncRNA7受c-Myc的正调控。

2.3pLKO.1-shlncRNA7转染SCC3细胞后lncRNA7的表达将构建好的载体pLKO.1-shlncRNA7组及其pLKO.1-shlncRNA7-ctrl对照组转染入SCC3细胞，通过qRT-PCR检测lncRNA7的表达水平。结果表明，与pLKO.1-shlncRNA7-ctrl对照组相比，pLKO.1-shlncRNA7组中lncRNA7表达水平明显降低(F=278.639，P<0.05)，见图3。

图2 c-Myc对lncRNA7表达的影响A: 下调c-Myc后lncRNA7的表达情况；B：上调c-Myc后 lncRNA7的表达情况；与pLKO.1-shc-Myc-ctrl对照组比较：*P<0.05；与Flag对照组比较：#P<0.05

图3 lncRNA7表达情况与pLKO.1-shlncRNA7-ctrl对照组比较：*P<0.05

2.4lncRNA7对SCC3细胞生长的影响利用上述成功表达shlncRNA7的SCC3细胞进行MTT实验。结果表明，与pLKO.1-shlncRNA7-ctrl对照组相比，pLKO.1-shlncRNA7组在转染0、6、12、24 h SCC3细胞生长差异无统计学意义，但转染48 h后，pLKO.1-shlncRNA7组细胞增殖速率明显低于pLKO.1-shlncRNA7-ctrl对照组，且与对照组SCC3细胞克隆数差异有统计学意义(F=265.457，P<0.05)，见图4。

2.5lncRNA7对SCC3细胞增殖能力的影响利用上述成功表达shlncRNA7的SCC3细胞进行细胞克隆实验。结果表明，与pLKO.1-shlncRNA7-ctrl对照组相比，pLKO.1-shlncRNA7组细胞克隆数量明显减少(F=69.120，P<0.05)，见图5。

图4 转染shlncRNA7后SCC3细胞生长情况与pLKO.1-shlncRNA7-ctrl对照组比较：*P<0.05

图5 转染shlncRNA7后SCC3细胞克隆数量情况 结晶紫染色

2.6lncRNA7在SCC3细胞中的定位荧光原位杂交实验结果表明lncRNA7定位于SCC3细胞质中，见图6。因此，可以初步推测lncRNA7于细胞质中发挥上述功能。

3 讨论

舌鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，具有较高转移率和死亡率[4]。目前通常采用外科手术联合放疗和化疗等综合手段治疗，但舌鳞癌患者的5年生存率仍然不够理想[5]。因此，从基因水平上寻找舌鳞癌潜在的分子机制来改善治疗策略十分必要。

近年来，lncRNA引起了越来越多学者的关注，其在肿瘤中的异常表达和突变通过细胞增殖、侵袭和转移促进了肿瘤的发生发展。例如，lncRNA CRNDE在肝癌细胞中高表达并能促进肝癌进展[6]；lncRNA LOC554202在结肠癌中低表达且与TNM分期、组织学分级及淋巴结转移等因素相关[7]。Myc基因家族是已被发现的一组癌基因。c-Myc作为Myc家族的一员，通常被认为在细胞周期、增殖、分化和凋亡过程中发挥重要调控作用[8]。c-Myc癌基因及其蛋白产物几乎在所有类型恶性疾病中均有表达的升高[9]。Hu et al[10]在非小细胞肺癌中通过染色质免疫沉淀等一系列实验证实c-Myc可与lncRNA BCYRN1基因的启动子区域结合并靶向其上调，导致细胞运动和侵袭能力增加；另有研究[11]显示lncRNA PCAT-1能上调c-Myc蛋白，促进前列腺癌细胞增殖，其通过Myc 3’非翻译区(untranslated region，UTR)在转录后水平调控c-Myc，并且还观察到PCAT-1能够经miR-34a干扰Myc的调控。因此，这些证据都表明c-Myc与lncRNA在肿瘤发生发展中密切相关。然而，对c-Myc相关lncRNA在舌鳞癌中作用的研究甚少，仍有待发展。

本实验通过基因芯片发现了舌鳞癌细胞SCC3中受c-Myc正调控的lncRNA7，并通过下调和上调c-Myc，进一步验证其对lncRNA7表达水平的影响，发现lncRNA7表达的确受c-Myc的正调控。将SCC3细胞中敲低lncRNA7作为实验组，shctrl作为对照组进行MTT实验，在最初转染的0、6、12、24 h,两组SCC3细胞生长基本无差异，随着时间的延长，转染48 h后开始观察到与对照组相比，shlncRNA7实验组细胞增殖速率有所降低，且SCC3细胞增殖数与对照组相差也越发显著；此外，对两组细胞还进行了细胞克隆实验，shlncRNA7实验组细胞克隆形成数量明显少于对照组；通过以上两个实验证实敲低lncRNA7可以抑制SCC3细胞增殖。最后通过荧光原位杂交实验证实了lncRNA7定位于SCC3细胞质中，由此可初步推断敲低lncRNA7抑制SCC3细胞增殖和克隆是于细胞质中发挥的作用，这可为进一步探究lncRNA7在细胞中的功能提供线索，也为临床舌鳞癌的基因治疗提供理论依据。

图6 lncRNA7在细胞中的定位情况 Hoechst染色×160A：红色代表lncRNA7；B：蓝色代表用Hoechst染色的细胞核；C：A和B结合