ApoJ基因修饰的BMSCs移植对脑出血大鼠C3表达的影响

刘茂春，刘 亮，普 娟，陈 慧，徐 斌，刘学良，郑晓梅

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是指原发性非外伤性脑实质出血，是急性脑血管病中的危重类型，严重威胁着人类的健康，且至今缺乏决定性的治疗策略，目前对脑出血治疗的探索仍是研究的热点与难点[1]。研究[2]表明继发性脑损伤是ICH后神经损伤的主要原因，而补体级联反应在其中发挥着重要作用。近年来，细胞移植和基因疗法给脑出血的治疗带来了新的希望。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是干细胞移植治疗脑出血的理想细胞供体和转基因细胞载体[3]。近来，载脂蛋白J(apolipoprotein J,ApoJ)在多种中枢神经系统疾病中的神经保护作用逐渐引起大家的重视[4]，但目前国内外关于ApoJ在脑出血方面的研究并不多。ApoJ具有确切的补体调节功能，它能否通过抑制脑出血后的补体激活发挥神经保护作用，是本研究的出发点。

本课题组前期实验成功利用脂质体介导重组pEGFP-N1-ApoJ质粒转染大鼠BMSCs，经免疫细胞化学法、RT-PCR和Western blot等技术证实转染后的BMSCs能够稳定大量表达ApoJ蛋白[5-8]；并将转染细胞移植入大鼠脑出血部位，通过Western blot检测发现转染细胞能够在ICH大鼠脑组织内表达ApoJ蛋白[9]，证实转染后的BMSCs具有活性。在前期研究的基础上，该实验利用ApoJ基因修饰的BMSCs干预大鼠ICH模型，通过免疫组化和RT-PCR法检测补体C3的表达，旨在探讨ApoJ对脑出血大鼠的神经保护作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与主要试剂6～8周龄SPF级雄性SD大鼠73只(1只细胞培养，72只造模)，体质量250 g左右，购自西南医科大学实验动物中心。α-MEM 培养基(美国HyClone公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，重组质粒pEGFP-N1-ApoJ(上海生博生物医药科技有限公司)，脂质体LipofectaminTM2000及TRIzol Reagent试剂盒(美国Invitrogen 公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser及SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒(北京TaKaRa 公司)，兔抗大鼠C3多克隆抗体(武汉博士德公司)，HRP标记山羊抗兔IgG(武汉阿斯本生物技术有限公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1BMSCs的分离和培养 颈椎脱臼处死大鼠，75%乙醇浸泡5 min，无菌分离股骨和胫骨，去两端骨骺，用注射器吸取α-MEM培养基反复冲洗骨髓腔，冲洗液1 000 r /min 离心5 min，弃上清液，用含10%胎牛血清的新鲜α-MEM培养基重悬细胞，接种于培养瓶，于37 ℃、5% CO2饱和湿度孵育箱中培养，24 h首次半量换液，72 h全量换液，以后每3 d换液1次。每日于倒置显微镜下观察贴壁细胞形态及生长状况，当细胞增殖达80%～90%融合时，按1 ∶3比例传代培养。

1.2.2重组质粒转染BMSCs及转染效果的评价 将生长良好的第3代BMSCs以(4～5)×106/个接种至6孔板，待细胞70%～80%融合时，按参考文献[6]的转染方法，用3 μl脂质体LipofectaminTM2000介导1.6 μg重组pEGFP-N1-ApoJ质粒瞬时转染BMSCs。转染后24、48、72 h分别在荧光显微镜下观察细胞的绿色荧光蛋白表达情况，并选择10个荧光分布均匀的视野，计算转染效率，转染率=10个视野转染阳性细胞数之和/10个视野细胞总数。收集转染效率最高的细胞悬液，行流式分选后，调整细胞浓度为2×107个/ml备用。

1.2.3大鼠ICH模型的建立 腹腔注射3%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠，俯卧位固定于脑立体定位仪上，定位右侧尾状核(以前囟为中心，向后0.2 mm，右侧旁开3 mm，深6 mm)，钻孔，断尾取血，采用经典的“改良二次注血法”注血，第一次匀速注血20 μl(耗时2 min，留针7 min)，第二次注血30 μl(耗时4 min，留针10 min)，然后缓慢拔针，缝合切口。造模后2 h用改良神经功能评分法(modified neurological severity score，mNSS)对大鼠进行神经缺失评分，8分以上视为造模成功。

1.2.4实验分组与细胞移植 造模后24 h，将72只ICH大鼠随机分为3组：ApoJ/BMSCs组、BMSCs组和NS组，每组24只。3组分别移植30 μl ApoJ基因修饰的BMSCs悬液(6×105个)、BMSCs悬液(6×105个)和生理盐水至脑出血部位(方法：再次麻醉、固定大鼠，原骨孔处垂直进针，分别在进入5、6、7 mm时各缓慢匀速推入细胞悬液10 μl，留针10 min后缓慢拔针，缝合皮肤)。各组再根据移植后再喂养时间不同，分为1、3、5、7 d 4个亚组，每亚组6只。

1.2.5组织取材 相应时间点腹腔麻醉各亚组大鼠，直接断头取脑，用于免疫组织化学染色的脑组织标本用4%多聚甲醛固定，然后常规脱水、透明、石蜡包埋、切片(片厚5 μm)；用于RT-PCR检测的组织标本放入-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.6免疫组织化学染色 切片脱蜡至水，1 mmol/L EDTA缓冲液中微波加热行抗原修复，3% H2O2室温孵育10 min(以清除内源性过氧化物酶活性)，5% BSA封闭20 min，滴加一抗 (兔抗大鼠C3多克隆抗体，1 ∶150) 4 ℃过夜，加二抗 (HRP标记山羊抗兔IgG，1 ∶200)37 ℃孵育50 min，以上各步骤结束时均用PBS洗3次，每次5 min；然后加DAB溶液显色10 min，最后苏木精复染，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。在Olympus光学显微镜下观察，胞质或胞核呈棕黄色者为阳性细胞，并应用 Image Pro Plus 6.0专业图像分析软件测量C3的累积光密度值(IOD)，从而对C3蛋白的表达进行半定量分析。

1.2.7荧光实时定量PCR 取血肿周围脑组织约100 mg，利用TRIzol试剂提取总RNA；取10 μl RNA按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书进行反转录合成第一链cDNA；采用SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒进行PCR 扩增，反应体系为：2×qPCR Mix 5.0 μl、引物工作液1.0 μl、cDNA模板1.0 μl、ddH2O 2.8 μl、Rox 0.2 μl，反应条件为：预变性 95 ℃ 1 min，变性95 ℃ 15 s、退火58 ℃ 20 s、延伸72 ℃ 45 s，循环40次；熔解曲线60 ℃→95 ℃，每20 s升温1 ℃。每个样品均作3个复孔，同时扩增GAPDH作内参。用ΔΔCT法计算补体C3 mRNA 的表达量。引物由武汉金开瑞生物工程有限公司设计与合成，引物序列如表1。

表1 GAPDH、C3引物序列

2 结果

2.1BMSCs分离及形态学观察骨髓细胞初始分离时，悬浮于培养液中，呈圆形或椭圆形，大小不一。原代培养24 h换液后可见细胞基本贴壁，呈圆形、短梭形或多角形等多种形态(图1)。之后3～5 d圆形细胞明显减少，梭形细胞为主，呈放射状排列的细胞集落并互相融合。第6天梭形细胞集落增多，细胞融合达90%以上，呈旋涡状排列(图2)。经多次换液和传代，细胞不断纯化，传至第3代时，可得到纯度高、形态均一、生长良好的BMSCs(图3)。

2.2转染后荧光观察及转染效率的测定转染后随时间的延长，表达绿色荧光蛋白的阳性细胞逐渐增多，72 h时绿色荧光表达最强(图3、4)，转染效率最高，约36%左右。

2.3免疫组化结果各组各时间点脑出血灶周边区都可见补体C3蛋白表达，C3主要表达于神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞及中性粒细胞的胞质。ApoJ/BMSCs组和BMSCs组在1、3、5、7 d随时间的延长，C3蛋白的表达逐渐降低，其中ApoJ/BMSCs组各时间点C3蛋白的表达低于同时间点BMSCs组和NS组，BMSCs组又低于同时间点NS组，差异均有统计学意义(P<0.05)(表2、图5)。

表2 各组不同时间点C3蛋白的表达变化

与BMSCs组比较：*P<0.05；与NS组比较：#P<0.05

图1 BMSCs原代培养第1天 ×200 图2 BMSCs原代培养第6天 ×40 图3 第3代BMSCs ×100 图4 第3代BMSCs转染72 h ×100

图5 C3在各组脑组织中的表达情况 ×200A：ApoJ/BMSCs组；B：BMSCs组；C：NS组；1：1 d；2：3 d；3：5 d；4：7 d

表3 各组补体C3的mRNA表达

与BMSCs组比较：*P<0.05；与NS组比较：#P<0.05

2.4PCR结果随时间的延长，ApoJ/BMSCs组和BMSCs组补体 C3 mRNA 的表达逐渐降低，其中ApoJ/BMSCs组各时间点C3 mRNA的表达明显低于同时间点BMSCs组和NS组，BMSCs组又低于同时间点NS组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3、图6。各组补体C3和内参GAPDH的mRNA 表达扩增图谱，见图7。

图6 各组补体C3 mRNA 的相对表达水平A：ApoJ/BMSCs组；B：BMSCs组；C：NS组；1：1 d；2：3 d；3：5 d；4：7 d；与NS组比较：*P<0.001; 与BMSCs组比较：#P<0.001

3 讨论

载脂蛋白J是一种广泛存在于各种组织和体液中的多功能糖蛋白，具有众多生物学功能，主要包括：转运脂质、抗动脉粥样硬化、调节补体、抑制氧化应激、抗凋亡、保护细胞膜、促进损伤组织修复及调节生殖等[10]。ApoJ作为一种非典型热休克蛋白，脑损伤后其表达的上调是一种机体内源性应激保护反应[11]。但具体的神经保护作用机制目前尚未完全明确，有学者认为可能与其补体调节功能有关。前期郑晓梅 等[12]研究发现ApoJ对脑出血大鼠的内源性保护作用可能是通过抑制补体激活而实现的。

补体C3是补体系统发挥作用的核心，可作为补体活化的指标。补体系统通过3条激活途径产生补体受体1的配体(C3b)[13]，最终形成膜攻击复合物(membrane attack complex，MAC)C5b-9，MAC损伤胞膜导致靶细胞溶解死亡[14]。脑出血后补体激活诱导细胞膜攻击，导致炎症反应、细胞凋亡、血脑屏障破坏和脑水肿[15-16]。研究[17]显示应用补体抑制剂治疗脑出血效果显著，而ApoJ作为确切的补体抑制因子，可能成为脑出血新的治疗措施。

图7 补体C3和内参GAPDH的mRNA 表达扩增图谱A:补体C3; B:内参GAPDH

本研究旨在探讨ApoJ对脑出血大鼠的神经保护作用机制。前期研究已经证实外源性ApoJ能够成功转染BMSCs，且携带ApoJ基因的BMSCs能够在ICH大鼠脑组织内表达ApoJ蛋白，本实验的转染结果与文献[5-8]结果一致，证实转染成功。本实验利用外源性ApoJ干预大鼠ICH模型，通过免疫组化和RT-PCR法分别检测C3蛋白和mRNA的表达变化。结果显示，ApoJ/BMSCs组和BMSCs组的C3表达随时间的延长逐渐降低，其中ApoJ/BMSCs组又显著低于同时间点BMSCs组。表明ApoJ/BMSCs组和BMSCs组均能下调C3的表达，但ApoJ/BMSCs组下降更为显著，从而推测ApoJ基因修饰的BMSCs较单纯BMSCs更能抑制脑出血后的补体级联反应。其实早在1989年Jenne et al[18]便已发现ApoJ可通过结合补体C5b-7而终止补体级联反应。2016年Huang et al[4]通过侧脑室注入人重组ApoJ蛋白干预脑损伤大鼠模型，发现ApoJ可通过抑制脑损伤后补体激活和氧化应激反应，减轻炎症反应、保护血脑屏障和减轻脑水肿，促进大鼠神经功能恢复，本实验结果与之相符。

本研究证实了ApoJ对脑出血大鼠的神经保护作用是通过抑制补体激活机制而实现的，是否还有其他机制的参与需要进一步深入研究，这为进一步研究ApoJ对脑出血的治疗作用提供了新的理论依据。