BDNF在慢性不可预见性温和刺激应激大鼠海马星形胶质细胞中的表达

吴红芳，金齐颖，曹金英，马原源，张园园，刘 昊

抑郁症虽然发病机制未明，但可以肯定的是长期慢性应激可以促进抑郁症的发生，严重威胁人类健康[1]。近年来关于抑郁症发病机制的研究主要集中在非单胺类神经递质的假说，如细胞因子、谷氨酸及其受体、脑源性神经营养因子假说、下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)亢进假说等。星形胶质细胞在维持神经系统内环境稳定中起到至关重要的作用，其结构和功能异常可能与抑郁症发病存在联系。脑源性神经营养因子(brain-derived neurophic factor，BDNF)是神经元细胞存活及再生的关键因子之一[2]。动物实验研究[3-4]表明，BDNF表达异常与抑郁症有关。目前国内外抑郁症发病机制方面多集中于对海马神经元细胞的研究，对于海马部位星形胶质细胞的研究少有报道。该研究建立大鼠抑郁症模型，观察大鼠海马星形胶质细胞BDNF表达情况，以期对抑郁症的发病机制研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1动物及试剂① 实验动物：成年清洁级(SPF)SD大鼠(雄性，体质量160～220 g)60只，(华北理工大学动物饲养实验中心提供)，实验前先给予7 d常规适应性饲养。饲养条件：室温恒定(22～25 ℃)，每笼饲养3～5只，昼夜节律(12 h/12 h)，自由获取食物和自来水。② 主要试剂：兔抗BDNF多克隆抗体购自上海Protein Tech公司；小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；免疫印迹相关试剂购自武汉博士德生物工程有限公司；羊抗胶质纤维酸性蛋白(glial fabrilary acidic protein,GFAP)抗体、羊抗兔lgG/Alexa Fluor488、羊抗鼠lgG/Alexa Fluor647均购自北京博奥森生物技术有限公司；石蜡切片机(HZ1220)、激光共聚焦显微镜(TCSSP8 STED)购自德国徕卡公司。

1.2实验大鼠的处理采用随机数字表法，将大鼠分为两组：① 对照组：共30只，不做特殊处理；② 应激组：共30只，给予慢性不可预见性温和刺激(chronic unpredictable mild stimulation，CUMS)处理。应激如下：鼠笼摇晃15 min；行为束缚24 h；鼠笼45°倾斜24 h；4 ℃的冰水游泳5 min；42 ℃的热水游泳5 min；禁水24 h；禁食24 h；双耳电击5 s两次(0.8 mA)；夹鼠尾60 s；潮湿垫料24 h；黑白颠倒(如持续光照24 h或持续黑暗24 h)。每天随机选取1种刺激方法，但确保同种刺激不连续使用，共进行28 d。对照组无特殊处理，除每天抓取1次。应激结束后第1 、7、14天处死应激组和对照组大鼠。

1.3行为学检测① 糖水偏好实验：实验前先让大鼠禁水禁食1 d，把两个完全相同水瓶放置在每个鼠笼内，200 ml 1%的糖水和200 ml的纯净水分别灌入两水瓶内，双瓶供饮，确保水瓶完好无滴漏，测量糖水和纯净水的消耗量(60 min内)，计算大鼠的糖水偏好率，糖水偏好率(%)=糖水消耗量(ml)/总液体消耗量(ml)×100%。② 旷场实验：造模成功后，每天同一时间段内将1只大鼠放入旷场中心方格(规格：长120 cm，宽120 cm，高35 cm)内，使用鼠博士视频分析仪进行记录，主要包括：行走总路程、中央活动时间、竖立次数和修饰次数。③ Morris水迷宫实验：连续3 d大鼠在1 min内找到水下平台的时间，并利用相关仪器记录，即逃避潜伏期，每天6个循环。根据3 d的测试结果计算空间记忆成绩。

1.4免疫荧光双标① 标本制备：将各组大鼠麻醉后行多聚甲醛灌流固定，冰冻切片，片厚度为15 μm。② 免疫荧光双标染色：将冰冻切片从-80 ℃冰箱取出，室温放置30 min，按免疫组化学步骤进行免疫荧光双标染色，一抗混合液(兔抗BDNF多克隆抗体和羊抗GFAP混合液)使用浓度1 ∶100，阴性对照用PBS代替一抗，Alexa Fluor488标记的羊抗兔和Alexa Fluor647标记的羊抗鼠荧光二抗混合液使用浓度1 ∶200，DAPI复染核，封片剂封片并置于避光盒内，最后通过激光共聚焦显微镜观察并应用计算机进行数据采集和成像。

1.5Westernblot检测大鼠海马BDNF的蛋白表达大鼠完全麻醉后，断头取脑，在冰上剥离海马，提取组织总蛋白。用BCA蛋白试剂盒测定上清液中的蛋白质浓度，根据BCA法测定的蛋白上样量(30 μg)上样，之后12% SDS-PAGE电泳，再之PVDF膜电转，封闭2 h(5%BSA)，相应一抗兔抗BDNF多克隆抗体(1 ∶400)置于4 ℃的冰箱内孵育过夜，相应的二抗羊抗兔IgG(1 ∶1 000)室温孵育1 h，ECL显色。内参β-actin应用同样的步骤操作并进行分析。计算目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1糖水偏好实验结果在普通水消耗量上，应激组与对照组比较差别无意义(P>0.05)；但在糖水消耗量及糖水偏好率上，两组间差异均有统计学意义(P<0.01)，而且应激组较对照组均偏低，见表1。

2.2旷场实验和Morris水迷宫实验应激组与对照组相比，大鼠的行走总路程、中央活动时间、竖立次数、修饰次数、平均逃避潜伏期差异均有统计学意义(P<0.01)，其中，与对照组比较，应激组的行走总路程、中央活动时间、竖立次数、修饰次数均降低，而平均逃避潜伏期较对照组明显延长，见图1、表2。

2.3GFAP和BDNF免疫荧光双标结果GFAP为绿色荧光，BDNF为红色荧光，GFAP和BDNF两种蛋白荧光Merge之后呈现黄色(见图2A4、B4)，表明部分星形胶质细胞的胞质内GFAP和BDNF同时表达，说明GFAP和BDNF有部分共定位。两者比较，应激组(CUMS后1 d)GFAP-BDNF双重染色的细胞数及BDNF均较对照组明显减少。见图2。

表1 两组大鼠糖水偏好实验结果

图1 两组大鼠旷场实验和水迷宫实验轨迹图A：旷场实验；B：水迷宫实验；1：对照组；2：应激组

表2 两组大鼠旷场实验和水迷宫实验结果

图2 GFAP和BDNF免疫荧光双标结果 ×400A：对照组；B：应激组(CUMS后1 d)；1：GFAP细胞数；2：BDNF细胞数；3：细胞核；4：GFAP-BDNF双重染色细胞数

2.4各组大鼠海马组织中BDNF蛋白表达水平对照组、应激组大鼠应激刺激结束后1、7、14 d，海马组织中BDNF的蛋白表达水平分别为(0.795±0.023)、(0.313±0.017)、(0.631±0.013)、(0.719±0.037)，差异有统计学意义(F=761.304，P<0.001)。应激组蛋白表达水平虽逐渐增高，但均低于对照组(P<0.01)，见图3。

图3各组大鼠海马组织中BDNF蛋白表达水平1：对照组；2～4：应激组(CUMS后1、7、14 d)

3 讨论

本实验行为学检测结果表明，CUMS后大鼠表现出快感缺失，运动能力、探索行为、视空间和记忆力的减退等症状[5]，说明给予大鼠CUMS能较好地反映抑郁症的主要症状。

BDNF对维持神经元的分化、存活及可塑性具有重要作用，与抑郁症和焦虑有关[6]。研究[7-8]显示，抑郁症的发生和严重程度与BDNF蛋白的异常表达存在联系，但研究结果不一[9-11]。本研究结果表明，CUMS后1、7、14 d大鼠海马组织中BDNF的表达呈现逐渐增高的趋势，但均较对照组偏低。推测应激刺激后BDNF的表达并不是单一的下降或升高，而是存在一个动态的变化过程。

星形胶质细胞是神经系统功能活动中不可或缺的重要组成部分，但在抑郁症的发病过程中，关于星形胶质细胞的功能和作用，目前的研究相对较少。利用荧光标记法显示星形胶质细胞特异性标记蛋白GFAP，可以在原位显示星形胶质细胞[12]。本实验中，采用免疫荧光双标方法检测GFAP和BDNF的表达，结果显示给予CUMS应激后，大鼠海马部分星形胶质细胞胞质内GFAP和BDNF存在共定位，说明星形胶质细胞中有BDNF的合成。同时，本实验的Western blot结果表明CUMS后大鼠1、7、14 d海马组织中BDNF的蛋白表达均低于对照组，这种降低有可能由星形胶质细胞合成分泌BDNF降低引起。但本实验未对星形胶质细胞进行单独检测和分析，因此，给予CUMS应激导致的海马组织BDNF降低，在多大程度上由星形胶质细胞合成BDNF的变化而引起，就本实验结果看目前还不能确定。本研究结果提示给予大鼠CUMS后，海马星形胶质细胞BDNF出现改变，有必要进行深入研究。