吗啡与布托啡诺对肺腺癌细胞A549侵袭与迁移的影响

李 彬,薛 昀

目前肺癌主要的治疗方法为手术、放化疗及生物靶向治疗等综合治疗，而患者的主要死亡原因是肿瘤的复发和转移。研究[1-2]表明，阿片类药物对肿瘤的发展有一定的影响，其中μ受体及其激动剂可能促进肿瘤生长；而κ受体激动剂则抑制肿瘤生长。肿瘤患者在围术期镇痛及癌痛治疗中吗啡作为镇痛药物“金标准”被大量使用。吗啡为μ受体激动剂，是否促进肿瘤的侵袭及迁移；布托啡诺为κ受体激动剂是否抑制肿瘤的侵袭及迁移，目前这一领域的研究资料还较少，且研究方法不统一[3-4]。同时新型的阿片类药物开始用于临床麻醉和镇痛，对肿瘤的短期作用和长期影响亟待研究。该研究旨在探讨吗啡与布托啡诺对人肺腺癌细胞A549的侵袭及迁移的影响，以及对相关蛋白表达的作用机制，期望有助于优化临床用药习惯及改善肺癌患者术后生存。

1 材料与方法

1.1实验对象及分组人肺腺癌A549细胞购自中科院上海细胞库，接种于培养板，培养24 h后，随机分为吗啡组与布托啡诺组。每组分别设置不同浓度组：对照组(生理盐水)、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L。同时在吗啡组与布托啡诺组的基础上分别设置两组对应的特异性拮抗剂组：吗啡+甲基纳曲酮，布托啡诺+Nor-Binaltorphimine (Nor-BNI)；盐酸吗啡注射液(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，1 ml ∶10 mg，国药准字H20013351)；甲基纳曲酮(上海意杰生物科技有限公司，5 mg，国药准字A3596)；布托啡诺注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司，2 ml ∶4 mg，国药准字H20143106)；Nor-BNI(博奥派克生物，10 mg，货号ab120078)。每组分别加入对应浓度药物后孵育36 h，检测其侵袭及迁移能力。

1.2试剂与仪器胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司；RPMI-1640细胞培养液购自美国GibcoBRL公司；二甲基亚砜(DMSO，分析纯)购自江苏鸿声化工厂；Western blot试剂(抗体稀释液和抗体去除液)、免疫荧光试剂(细胞核荧光染液DAPI)购自上海碧云天公司；ECL发光液购自美国Thermo Scientific公司；免疫组化试剂(SP9000通用型组化试剂盒、DAB显色剂)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；苏木精、伊红等染色液及Triton X-100购自北京索莱宝生物公司；PVDF膜(0.45 μm)购自美国Millipore公司；3111型CO2培养箱、CL17R型冷冻高速离心机购自美国Thermo Forma公司；低温冰箱购自台湾SANYO公司；SENCO R-201旋转蒸发仪购自上海中顺生物科技有限公司；细胞培养板和培养瓶购自丹麦NUN CLON公司；XPS-18型倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司；Western blot检测系统与凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司；Leica Bond-Max免疫组化仪购自北京昊诺斯科技有限公司(德国生产)。

1.3Transwell法检测细胞侵袭能力将冻存于-20 ℃的Matrigel与无血清培养液1 ∶6稀释，每孔15 μl加入Transwell小室，37 ℃静置1 h。转染24 h消化后，1 000 r/min离心1 min，去上清液，加入各组无血清培养液及1×105个细胞，用DMEM稀释至400 μl，每组设3个复孔。向小室下层加入含10% FBS DMEM的600 μl培养液，培养在含5% CO2、37 ℃恒温箱24 h。然后吸去嵌室内液体，用PBS洗3次，加入90%乙醇固定30 min，吸出乙醇后PBS洗2次，用0.1%结晶紫染色30 min，风干后，荧光显微镜下(×200)随机选择5个视野拍照并计平均数。

1.4细胞划痕法检测细胞迁移将A549细胞接种到6孔板，细胞密度为铺满培养板80%时转染，转染6 h后换液，继续培养至细胞长满培养板，用20 μl枪头垂直于细胞平面划痕，用PBS洗5次，洗去细胞残留，更换培养基，以划痕时间点记做0 h，每隔12 h拍照。各样品均取5个视野测量距离。细胞迁移率(%)=(0 h时划痕距离-24 h时划痕距离)/0 h时划痕距离×100%。

1.5Westernblot实验每组1×107个细胞，加入预冷蛋白裂解液200 μl，4 ℃下裂解1 h，冰浴下超声裂解15 min，12 000 r/min离心20 min，上清液用BCA定量试剂盒测定基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)-2、MMP-9、成束蛋白(Fascin)的浓度。利用8% SDS-PAGE电泳50 μg总蛋白，转膜，用5%脱脂牛奶封闭1 h后加入1 ∶1 000稀释的小鼠抗人单克隆抗体，4 ℃孵育12 h。接着TBST清洗3次，每次10 min，加入1 ∶3 000稀释的山羊抗小鼠HRP标记二抗，重复以上清洗，最后采用Pierce公司生产的超敏ECL试剂暗室曝光检测蛋白条带。

2 结果

2.1布托啡诺和吗啡对A549细胞侵袭能力的影响与对照组比较，随着布托啡诺剂量的增加，A549细胞侵袭数明显减少，而随着吗啡剂量的增加A549细胞侵袭数明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明布托啡诺可抑制肺腺癌细胞的侵袭能力，而吗啡反之。见图1。

2.2各组细胞培养0、12、24h的迁移情况比较与对照组比较，随着布托啡诺剂量的增加及时间延长，A549细胞迁移变化不明显，而随着吗啡剂量的增加A549细胞迁移数明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明布托啡诺可抑制肺腺癌细胞的迁移能力，而吗啡反之。见表1和图2、3。

表1 各组细胞迁移率的比较

与对照组比较：*P<0.05；与0.1 μmol/L比较：#P<0.05；与1 μmol/L比较：△P<0.05

图1 布托啡诺与吗啡对A549细胞侵袭能力的影响 ×200A：布托啡诺；B：吗啡；1：对照组；2：0.1 μmol/L;C:1 μmol/L;D:10 μmol/L

图2 各组细胞培养0、12、24 h的迁移情况比较 ×100A：布托啡诺；B：吗啡

图3 各组细胞迁移率的比较

2.3Transwell法检测加入拮抗剂各组的侵袭能力与对照组比较，随着布托啡诺特异性拮抗剂Nor-BNI剂量为0.1 μmol/L时，A549细胞侵袭数明显增加，而1 μmol/L与10 μmol/L的剂量变化不明显。与单纯布托啡诺组对应的剂量比较，可明显观察到加入Nor-BNI后，每组对应剂量的A549细胞侵袭数明显增加。与单纯吗啡组对应的剂量比较，随着吗啡特异性拮抗剂甲基纳曲酮剂量的增加，A549细胞侵袭数明显减少。结果表明布托啡诺可抑制肺腺癌细胞的侵袭能力，而吗啡反之。见图4。

图4 Transwell实验检测培养24 h布托啡诺+Nor-BNI与吗啡+甲基纳曲酮对A549细胞侵袭能力的影响 ×200A：布托啡诺+Nor-BNI；B：吗啡+甲基纳曲酮；1：对照组；2：0.1 μmol/L;C:1 μmol/L;D:10 μmol/L

2.4Westernblot检测MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白的表达与对照组比较，10 μmol/L布托啡诺作用肺腺癌A549细胞24 h后，MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白表达下调，而吗啡作用后MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明布托啡诺可以抑制肺腺癌细胞的迁移能力，而吗啡反之。见图5、6、表2。

图5 Western blot法检测各稳定转染细胞系MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白的表达

图6 10 μmol/L布托啡诺与吗啡作用肺腺癌A549细胞24 h后MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白的表达

表2 10 μmol/L布托啡诺与吗啡作用肺腺癌A549细胞24 h后MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白的表达

t1、P1：10 μmol/L吗啡与对照组比较；t2、P2：10 μmol/L布托啡诺与对照组比较

3 讨论

研究[5]显示术后阿片类药物的使用可能会增加癌症的复发，降低Ⅰ期和IIa期非小细胞型肺癌(NSCLC)患者的存活率。另一项研究[6]也表明术后μ受体激动剂可降低整体生存率和早期NSCLC患者的无病生存时间。然而，Cata et al[7]却发现静脉或者硬膜外镇痛的NSCLC患者在2年或5年生存率方面没有显著差异。目前，阿片类受体激动剂是目前最常用的癌症慢性疼痛及围手术期的止痛药，如吗啡为阿片μ受体激动药，而布托啡诺则是κ受体激动剂。对于μ受体激动剂而言，一方面可通过抑制机体免疫力，同时促进术后残留癌细胞的存活而增加癌症复发率；对于κ受体激动剂而言，可能通过降低肺癌细胞糖原合成激酶3β的磷酸化从而抑制NSCLC细胞生长[8]。近年来，阿片类镇痛药物对肺癌的作用机制受到国内外关注，但争议较大[9]。研究[10]显示吗啡、布托啡诺等对肿瘤转移和侵袭有一定的影响，并表明不同的麻醉药物及浓度对不同类型的肿瘤细胞的影响差异较大。本研究显示，随着吗啡浓度的增加对促进肺腺癌细胞A549的侵袭和迁移能力逐渐增强。

目前MMP家族中明胶酶MMP-2、MMP-9是研究较普遍的2种[8]。研究[9]表明，MMP-2、MMP-9的表达对肿瘤的侵袭和转移有影响。吗啡在肿瘤细胞侵袭和迁移中的作用仍存在较多争议，有促进或抑制转移侵袭的结果[11]，而布托啡诺多用于胃癌、肝癌、食管癌等术后自控镇痛、镇静，在肿瘤的转移和侵袭方面国内没有相关报道。本研究显示，吗啡促进肺腺癌细胞A549的侵袭和迁移，并上调了MMP-2、MMP-9的表达；而布托啡诺反之，这与阿片类药物μ受体及其激动剂可能促进肿瘤生长；而κ受体激动剂则抑制肿瘤生长较一致。成束蛋白Fascin在脑、卵巢等组织中呈高表达，其在不同类型细胞中表达不同[12]。韩铁鹏 等[13]发现无论鳞癌还是腺癌，Fascin蛋白高表达与肿瘤的分期，淋巴结转移和患者预后显著相关，而且Fascin蛋白高表达是早期NSCLC患者预后的独立危险因素。本研究显示，吗啡明显上调了肺腺癌细胞A549中Fascin蛋白的表达；而布托啡诺反之，而具体的作用机制需研究药物作用的药代动力学、靶点相关基因表达及相关蛋白受体的表达，阿片μ受体的多态性，同时学习μ受体和κ受体表达的表达水平对于不同患者肺癌预后的影响[11]。

Oosten et al[14]研究了癌症患者吗啡代谢的药代动力学表明，血药浓度与治疗结果呈正相关性。Afsharimani et al[15]认为所用模型间差异导致目前吗啡对癌细胞转移和侵袭性的差异性结论。本研究显示，吗啡促进肺腺癌细胞A549的侵袭和迁移，而布托啡诺反之，这与阿片类药物μ受体及其激动剂可能促进肿瘤生长，而K受体激动剂则抑制肿瘤生长较一致。这不排除其是共同作用的通路，但具体机制仍有待进一步研究。同时，本研究在不同浓度的吗啡与布托啡诺中加入对应的特异性拮抗剂，显示布托啡诺可抑制肺腺癌细胞的侵袭能力，而吗啡反之。

综上所述，吗啡可促进肺腺癌细胞A549的迁移与侵袭，而布托啡诺则抑制肺腺癌细胞A549的迁移与侵袭，可能与MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白表达相关，但具体机制有待进一步探究。