色谱分析中的串联技术

刘育坚, 杜甫佑, 刘智敏, 司小喜, 许志刚*

(1. 昆明理工大学理学院, 云南 昆明 650500; 2. 桂林理工大学化学与生物工程学院, 电磁化学功能物质广西重点实验室, 广西 桂林 541004; 3. 云南中烟工业有限责任公司技术中心, 云南 昆明 650231)

色谱法本身是一个高效的分离过程,目前只有与检测器串联才能实现目标组分的分离检测。色谱柱是色谱分离的“心脏”,组分能否分开,关键在于色谱柱,其次在于色谱条件的选择。色谱分析中常使用一根色谱柱,然而单根色谱柱的柱效是有限的,面对极为相似的复杂组分,单一色谱柱往往不能满足分离要求。采用分离性能不同甚至互补的两根或多根色谱柱串联,可以大大提高分离效果。因此,柱串联技术是一种分离技术升级,不是简单的两根色谱柱随机组合。而多维色谱技术则进一步改进了单一色谱溶剂系统难以同时分析组分极性相差甚远成分的难题。另外,检测器的串联也可以方便地实现不同种类、具有不同响应信号分析物的同时检测。

本文综合报道了自2010年色谱串联技术的研究进展,并且在相关研究[1-3]的基础上聚焦色谱分离中的串联技术,包括柱串联技术、检测器串联技术和多维色谱,为广大分离分析工作者提供新的技术选择,最后指出色谱串联技术发展中遇到的困难以及未来的发展趋势。

1 柱串联分离技术

1.1 液相色谱中的柱串联技术

液相色谱固定相种类繁多,已有适用于正相色谱的极性柱、适用于反相色谱的非极性柱、适用于水相的亲水作用色谱柱、适用于高盐溶液的离子色谱柱、适用于手性分离的手性柱等。液相色谱柱的串联需要考虑流动相与色谱柱的兼容性以及串联柱之间分离性能的互补性。

反相液相色谱柱与亲水相互作用色谱柱的串联易于实现,可用于分析极性和非极性化合物。极性化合物与普通反相色谱柱的固定相结合较弱,通常出现保留时间不稳定的情况,而在亲水作用色谱柱上可以实现极性化合物的保留,但分离效果较弱,将反相液相色谱柱与亲水作用色谱柱进行串联,可实现分离效果互补。朱丽波等[4]将C18色谱柱与亲水作用色谱柱进行串联,应用超高效液相色谱-质谱法同时分离测定了丙烯酰胺、己内酰胺、联苯胺和苯胺。Granafei等[5]建立了亲水作用色谱柱串联反相色谱柱的方法,分离了大豆中的磷脂混合物。Falasca等[6]采用C18色谱柱与亲水作用色谱柱分离从树鼩脑提取物中分离了多种疏水性较大差异的季铵化合物,包括乙酰胆碱,胆碱,肉毒碱,乙酰肉碱和其他7种低极性酰基肉碱。反相液相柱串联亲水作用色谱柱,有利于混合物样品中极性与非极性物质的分离,成功应用于葡萄酒中的酚类[7]、小鼠血清代谢物[8]、药物[9]及啤酒[10]等样品的分析。

对于复杂体系中的多类别结构类似化合物的分离,双柱有时难以满足分析的需求,需要多柱串联,以提高色谱分离的容量以及分辨率,以获得更大的分离度。对于填充色谱柱,增加色谱柱长度或降低固定相的粒径可以提高色谱的分辨率,但也导致色谱柱柱压会成比例增加。Shaaban等[11]基于3根填充亚2 μm颗粒的色谱柱串联,同时为了降低色谱柱的柱压,高效分离13种非甾体抗炎药和11种磺胺类药物,在80 ℃的柱温下进行分离。整体式色谱柱则具有相对较低的色谱柱柱压以及良好的性能,可用于连接多根色谱柱。Dear等[12]使用6根烷基键合的二氧化硅整体柱,理论塔板数达到40 000,对动物体内的尿液及胆汁体液中尿嘧啶、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丁酯和蒽等药物代谢物进行分离鉴定。在分析大体积的生物流体时,整体柱也表现出良好的稳定性,Sandron等[13]将11根整体C18柱串联,获得了理论塔板数高达110 000的高容量色谱柱,分析了海洋溶解有机物中的半极性和非极性组分,证明了主要组分为富含羧基的脂环族分子。

手性对映体的分离通常需要使用特殊的手性色谱柱,直接使用C18柱无法拆分对映体,而手性柱分离不同物质的能力较弱。将C18柱与手性色谱柱进行串联,结合C18柱的分离能力以及手性色谱柱的对映体拆分能力,可实现甲状腺素及其结构类似物三碘甲状腺氨酸对映体的同时拆分[14]。Iwasaki小组[15,16]建立了常规硅胶柱和手性柱串联分析单酸二酰基甘油3种异构体以及单酰甘油3种对映异构体的拆分方法。Perera等[17]将C18柱分别与3种手性柱串联,对16种手性药物进行了拆分,在使用极性有机溶剂-水作为流动相时依旧获得了较高的手性分离的能力。本课题组[18]也用C18柱与手性冠醚柱串联,在反相色谱条件下拆分了3种手性芳香族氨基酸的6种对映体(见图1),结果表明:手性柱和流动相的选择是影响串联分离的重要因素,而双柱的串联次序对分离基本没有影响,C18柱强化了不同种类氨基酸之间的分离度,也为手性柱进一步对对映体的分离提供了足够的空间距离,两者的串联实现了分离功能的互补。

图 1 C18柱串联冠醚手性柱拆分3种氨基酸外消旋体[18]Fig. 1 Separation of three amino acid enantiomers by C18 column tandem crown ether chiral column[18]

1.2 气相色谱中的柱串联技术

串联气相色谱作为传统一维气相色谱的补充,具有改装简单、易于操作和维护的优点,并克服了分辨率不足、峰容量不够高的缺点。为了减少分析时间,通过调节压力改变流速是气相色谱分离中的关键技术之一。Sacks小组[19]在解决气相色谱串联柱选择性方面做了大量工作:一方面通过改变串联柱连接点处的载气压力,影响组分在两根色谱柱上的保留时间,连接点处的载气压力通过计算机进行控制,另一方面采用在两根色谱柱的结合点上施加相对短的压力脉冲,降低组分共洗脱的风险,提高分离的选择性[20,21];相比于第一种方法,后者不会影响物质洗脱顺序以及分辨率,同时消除了样品损失和进样口污染的风险。该技术进一步应用于农药混合物[22]、柠檬油[23]、挥发性化合物[24-26]、橙油[27]的分离。另外,该小组[28]还改进了脉冲加热的方法,通过快速加热和快速冷却第二根色谱柱柱温来改善分离度,应用于大气中13种物质的分离。Wittrig等[29]通过调节双柱结合处的压力调节气相色谱的分离,在12 min内实现36个有机挥发性化合物的分离。Lv等[30]采用大气压气相色谱电离源串联质谱分析食品中的溴化阻燃剂,将一小段毛细管色谱柱连接到分析柱的末端,用于改善高沸点化合物的色谱行为。Ma等[31]将极性和非极性的色谱柱串联,用于分析冰酒中的香气化合物。Veschetti等[32,33]建立了等温下压力可调节的毛细管串联柱分离的理论模型,并且使用新的毛细管连接进行对照实验。而Jespers等[34]进一步将双柱串联技术应用于气相色谱的中进行程序升温,得到了程序升温气相色谱的动力学图。Guéguen等[35]采用双柱气相色谱-电子捕获检测器提高选择性,应用于树皮及空气样品中多氯联苯的分析。

1.3 超临界流体色谱中的柱串联技术

超临界流体色谱是一种广泛应用于食品和药物分析的分离技术,其流动相主要为超临界CO2和少量有机溶剂,色谱柱及其串联技术和液相色谱的极为类似。Di等[36]使用两根色谱柱测定血浆样品中依泽替米贝的药代动力学特性,West等[37]将C18柱和亲水作用色谱柱串联分析了25种合成药物中的杂质,柱串联显示了更高的分离能力和更好的选择性。超临界流体色谱柱串联在手性分析方面也有重要的应用,Barnhart等[38]使用两根不同种类的手性柱串联分析了含有4个对映异构体的手性药物,Lesellier等[39]将一根手性填充柱与不同数量的填充柱串联,用于顺式/反式-β-胡萝卜素的分离,结果表明一根手性色谱柱与5根整体柱串联时获得了最佳的分离效果。

此外,也有串联柱的快速筛选方法方面的研究。Welch等[40]使用两个不同软件控制两个六位高压阀,每个阀控制5根不同色谱柱,对商业化的超临界流体仪进行改进,能够从10根不同的色谱柱中筛选25种不同的串联方式,用于复杂组分的分离。Wang等[41]十分关注超临界流体色谱分离中的柱压,深入研究了柱压和串联柱顺序对分离的影响,并通过调节色谱柱的柱压,控制串联色谱柱手性分离的选择性。

2 检测器串联技术

检测器是色谱分析系统的核心部件之一,常见的有紫外吸收检测器、荧光检测器、蒸发光检测器、电化学检测器、氢火焰离子化检测器、质谱检测器等。这些检测器在常规分析中有足够的灵敏度、选择性和可靠性。然而,对于复杂的生物、医学、环境、食品样品,单个检测技术有时无法响应所有分析物,比如光电二极管阵列检测器在液相色谱中广泛使用,但对于紫外吸收较弱的化合物,如环糊精、多糖等,则需要采用蒸发光闪射检测器;采用硫化学发光检测器只能得到硫化物的相关信息。因此,使用基于不同原理的两种或多种检测器的串联,通过一次进样分析,即可同时检测样品中性质差异较大或具有不同相应信号的混合物,极大提高工作效率。表1中详细介绍了色谱分析中不同检测器的串联技术用于复杂样品的分析。此外,色谱与质谱的联用技术已十分成熟,如LC-MS、GC-MS、LC-MS/MS等,在此不再赘述。检测器的串联技术,为复杂样品的分析提供了一种新的途径,可以更高效的获得更多的样品信息,这项技术的关键在于检测器的串联接口以及不同检测器对流动相的兼容,这也一定程度上增加了仪器的成本。

表 1 检测器串联分析不同样品

DDT: dichlorodiphenyltrichloroethane; DAD: diode array detector; RI: refractive index; UHPLC: ultra high performance liquid chromatography; ELSD: evaporative light scattering detector; ECD: electron capture detector; NPD: nitrogen phosphorus detector; FPD: flame photometric detector; PID: photoionization detector.

3 多维色谱

多维色谱不仅仅使用多根色谱柱及多个检测器,色谱柱之间通过切换阀或压力平衡装置作为接口。多维色谱技术包括二维色谱、三维色谱、高维色谱。分离的维度以正交为依据,串联是实现多维分离的一种重要技术。对于天然产物、中药药物和蛋白质组分的分离,需要具有更大峰容量和更高分辨率的多维色谱技术来完成。

二维色谱的方法和技术较为成熟。传统二维气相色谱采用中心切割法,通常只能对部分组分进行分离,无法对全部组分进行准确的定性和定量。新的处理方法采用连续多次的中心切割方法,将一维分得的大部分色谱峰转移到第二维色谱柱继续分离而无需分馏。Lipok等[58]采用2D-GC与离子迁移谱和质谱相结合,用于金盏菊和银杏叶样品中化合物的分离,该2D-GC则需要较长的调制时间(20 s)和较长的第二维毛细管(7 m)。全二维气相色谱在两支色谱柱之间装有一个接口,起捕集、聚集、再传送的作用,它是全二维气相色谱中最重要的部件,被称为调制器。经第一根色谱柱分离后的每一个色谱峰,均经调制器调制后再以脉冲方式传送到第二根色谱柱进一步分离,全二维气相色谱具有选择性好和峰容量高等优点。全二维气相色谱可应用于奶油中脂肪酸[59]、石油中饱和烃组分[60]、植物油中微量脂肪酸烷基酯和甾醇[61]、土壤中多环芳烃[62,63]等样品和组分的分析。Chow等[64]对第二维分离进行程序控温,色谱柱在柱温箱内通过强制对流冷却,可有效改善分离效果。

二维液相色谱也可分为中心切割模式和全二维液相色谱。二维液相色谱与液相色谱柱串联具有相似之处,即可根据分析样品选择不同的色谱分离模式搭建二维液相色谱系统,如:反相色谱与强阳离子交换色谱相结合,用于肽段的分离[65];全自动停留系统的尺寸排阻色谱与反相色谱的联用,用于花生肽的分析[66];亲水相互作用色谱和反相色谱相结合,在全二维液相色谱模式下分析甘草成分[67];反相色谱与手性色谱相结合,将超快速手性色谱应用于第二维色谱分析中,提高手性分离效率[68]等。此外,Apel等[69]先使用正相色谱在近临界条件下通过流动相梯度法分离封端不同和支化度不同的聚合物,第二维采用尺寸排阻色谱获得分析物的分子量分布。为了降低全二维色谱分离蛋白质的时间,张祥民课题组[70]将“多维”与“阵列”技术相结合,即第一维采用阴离子交换色谱,第二维采用8根反相液相色谱柱和8根蛋白捕集柱,开展了多循环并行分离血浆中高丰度蛋白。第一维和第二维系统溶剂不兼容会影响二维液相的分辨率和灵敏度,Stoll等[71]采用新型阀技术解决第一维和第二维系统流动相兼容问题,且无需要额外的泵控制、操作方便。

不同类型的色谱分离技术亦能串联,已有液相色谱与气相色谱串联分别用于小鼠体内矿物油饱和烃[72]、橄榄油中三甲基甲硅烷基-4,4′-去甲基甾醇[73]、食用油中的甾醇[74]、化妆品中饱和烃和矿物油中芳烃的测定[75]等相关报道,也有液相色谱串联超临界流体色谱用于芳香油组分的研究[76]和木质素中的酚类物质的测定[77]。

面对极性差异巨大、组分含量悬殊的复杂样品,十分有必要构建更高维的色谱系统。在强阳离子交换色谱与反相色谱前增加一维色谱用于在线除盐,使得三维色谱系统可获得更准确的蛋白质识别[78]; Anderson等[79]则在第一维分离中使用凝胶柱,初步分离蛋白质组分,后续进一步对点状念珠藻的蛋白质组进行鉴定;Zhang等[80]将弱阴离子交换和弱阳离子交换材料填充的混合床离子交换柱用于复杂样品的第一维分离,进一步鉴定来自小鼠乳房肿瘤细胞裂解物中的肽。尺寸排阻色谱对蛋白质组学样品中分子量范围分布广泛的化合物表现出良好的分离性能,能将不同大小的蛋白分离至各组分中。Moore等[81]采用尺寸排阻色谱-反相色谱-毛细管区带电泳分析了鸡卵清蛋白肽。Al-Daghri等[82]第一步使用高效尺寸排阻色谱分离蛋白质组分,反相色谱收集水解后的混合肽馏分,最后在反相纳米喷雾FT-MS对馏分进行全血清蛋白质组学分析。而Spicer等[83]将3D RPLC-MS系统用于蛋白质和肽段的分离,相较于低维的色谱系统,高维系统具有更高的分辨率。Song等[84]构建亲水相互作用色谱-湍流色谱-反相液相(HILIC-TFC-RPLC)色谱平台,TFC收集HILIC分离的非极性化合物并转移至下一维进行分离,进一步将复杂基质中亲水和疏水物质进行分离。Wang等[85]采用停流界面来实现在线3D-LC系统,酰胺柱作为第一维柱,将弱极性代谢物和极性代谢物被分离成不同的组分,氟苯基柱和C18柱分别作为第二维和第三维分离柱,用于分析大豆提取物中的黄酮化合物。Gstöttner等[86]将商用的2D-LC改造成4D-LC,第一维分离中使用阳离子交换柱,第二维使用反相色谱柱收集第一维的组分,第三维则对上一维组分进行胰蛋白酶消化,最后一维获得肽的色谱图。

此外,也有气相色谱、液相色谱和超临界流体色谱之间的多维色谱构建。Edam等[87]在全二维气相色谱前增加一维液相色谱,构建三维系统(LC-GC×GC), LC系统可以分离饱和和不饱和烷烃组分,避免GC×GC出现峰重叠。将SFC替代LC与GC×GC连接可轻松地除去超临界CO2而不会损失挥发性样品组分,从而消除了共洗脱溶剂的引入以及稀释效应。搭建SCF-GC×GC可用于复杂样品中烃类化合物的分析[88,89]。Synovec小组则采用两个六端口隔膜阀作为接口串联三维气相色谱(GC×GC×GC),结合化学计量学中的平行因子对全三维气相色谱的分离进行方法评估[90];该小组进一步将飞行时间质谱引入到全三维气相色谱中,增加高温隔膜阀,有助于提高操作温度、减少样品裂解及有利于谱峰识别[91]。Yan等[92]设计了一种自动化的三维气相色谱分析装置,该装置结合了1DGC、MDGC(GC-GC)和GC×GC,开发植物天然提取物的三维色谱(GC-GC×GC)分析方法。Mitrevski等[93]将生物燃料油中的含氧化合物通过GC×GC的方法从基质中分离,然后通过中心切割法将含氧化合物转移到下一维GC分离,完成(GC×GC-GC)方法的搭建。该项技术进一步应用于(GC×GC-GC-GC)完成肟的顺反异构及其对映体的分离(见图2)[94]。

图 2 GC×GC-GC-GC分离肟的顺反异构及其对映体[94]Fig. 2 Separation of oxime cis-trans isomers and enantiomers by GC×GC-GC-GC[94]

4 结论与展望

分离与检测一直以来都是分析学科的焦点,并且也逐渐成为许多应用型和交叉学科中急需解决的重要问题的关键性技术环节之一。传统的色谱技术兼备了分离和检测双重功能,但单一的分离和单一的检测技术,都越来越难以满足超痕量样品分析、复杂样品分析、组学分析等需求。串联技术的运用,极大地加强了分离与检测的幅度和深度,不同的分离方法、分离模式的串联可实现分离的优势互补,不同的检测技术、检测仪器的串联可实现不同信号响应的同时监测,这为获取更加丰富和更加广泛的物质信息提供了技术保障。

然而,在色谱分析的串联技术中,也还有诸多的难点。(1)不同功能模块的串联,对接口有极高的技术要求,要便于拆卸和连接,也要保证良好的密闭性,同时还必须死体积尽量小；(2)样品、色谱固定相和检测器三者相容性好,这需要大量的尝试和样品分析,才能建立高效、通用的分析方法；(3)不同检测器的同时配备,增加了仪器成本。虽如此,但分离技术、检测技术的不断深入、融合,依旧是目前获得样品精准信息的最有效途径。