基于纳米金-适体结构的智能手机补色波长法检测磺胺二甲嘧啶

王 乐，李海琴，王美玲，张校亮，李晓春

(太原理工大学 新型传感器与智能控制教育部与山西省重点实验室，物理与光电工程学院，山西 太原 030024)

磺胺类抗生素是以对位氨基苯磺酰胺为基本结构衍生出的一类具有抗菌作用的特效药[1]，虽在人类疾病的治疗中起到了重要作用，但过量使用会对人体产生毒副作用，主要表现为毒性损伤、变态反应、过敏反应以及致癌、致畸、致突变“三致”效应。随着社会发展和人民生活水平的提高，抗生素的种类和用量不断增加，因不合理使用而产生不良影响的现象变得日益突出[2]。由于长期的不合理使用，各种含有大量抗生素的污水从工厂、养殖场排出，造成了对环境的严重污染。环境中的抗生素会导致生物体内产生耐药性基因，并对水生生物及人体产生危害。

目前，国内外用于检测抗生素的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[3-5]、色谱-质谱联用法[6]、毛细管电泳法(CE)[7]、免疫分析方法[8-9]以及荧光光度法[10]等。其中高效液相色谱法、色谱-质谱联用法的灵敏度和准确度高；毛细管电泳法主要用于少量样本的定量分析，具有分离效率高、节省试剂的优点；免疫分析方法检测快速、操作简单、特异性好。但以上方法需要大型仪器、操作复杂，因此不适合于现场的快速检测。

核酸适体(适体链)是一小段的DNA或RNA片段[11]，一般由30多个碱基组成。它是利用指数富集的配体进化技术(SELEX)从碱基库中筛选而来。由于适体链的出现，基于适体链的特异性检测抗生素的方法逐渐出现。2012年韩国Song等[12]首次利用SELEX方法筛选出磺胺二甲嘧啶(SDM)的适体，并利用该适体链结合荧光方法实现了SDM的检测，检出限为0.01 μg/mL，具有良好的特异性。陈爱亮课题组[13]提出了一种无需标记的基于适体-纳米金结构的SDM检测方法，该方法的线性范围为0～1 μg/mL，检出限为0.05 μg/mL。干宁等[14]提出了一种使用适体-双链DNA抗体-量子点探针结构实现荧光信号增强的氯霉素(CAP)的定量检测方法。

基于以上研究，并结合纳米金的聚集比色原理，本文提出了一种以纳米金颗粒与适体链为检测结构，同时利用智能手机补色波长分析检测磺胺类抗生素SDM的方法。该方法克服了传统检测方法对大型仪器的依赖，利用普通的智能手机对溶液进行拍照，通过App分析图片的补色波长实现了SDM的定量检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-3100紫外-可见光分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；TKAGenpure UV超纯水系统(美国赛默飞世尔公司)；78 HW-1数显磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司)；数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司)；HC-2518高速离心机(安徽中科中佳科学仪器)；混合器(德国IKA公司)；JEM-2000CX透视式电子显微镜(TEM，日本日立仪器有限公司)。

氯化钠、柠檬酸钠、硼氢化钠(美国Sigma-Aldrich公司)；氯金酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；磺胺二甲氧嘧啶(SDM，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；适体链GAGGGCAACGAGTGTTTATA(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 纳米金颗粒的制备

取1 g HAuCl4加入100 mL水中得到1%的HAuCl4溶液后，用水进一步稀释得到0.01%的HAuCl4溶液，取1 g 柠檬酸钠加入100 mL水中得到1%的柠檬酸钠溶液，取0.075 g NaBH4加入100 mL 1%的柠檬酸钠溶液中得到0.075%的NaBH4(溶于1%柠檬酸钠溶液)，随后在搅拌条件下向100 mL的0.01%HAuCl4溶液中加入1 mL 1%的柠檬酸钠溶液，1 min后，加入1 mL 0.075%的NaBH4溶液，混合物不停搅拌直至变为红色。

1.3 SDM 的检测

盐浓度的优化：首先将300 μL纳米金溶液加入PE管中，再分别加入0、2、 4、5、10、12.5 μL浓度为2 mol/L的NaCl溶液，最后向各PE管中加水定容至500 μL(得到NaCl溶液的浓度分别为0、0.008、0.016、0.02、0.04、0.05 mol/L)，振荡混匀后，在紫外-可见光分光光度计下扫描光谱，并分析实验结果。

适体链浓度的优化：将300 μL纳米金溶液加入PE管中，再分别加入0、5、 10、 25、50 μL浓度为10 μmol/L的适体链溶液(得到适体链的浓度为0、 0.1、0.2、0.5、1 μmol/L)，振荡混匀，5 min后再加入10 μL 2 mol/L的NaCl溶液，最后向各PE管中加水定容至500 μL，振荡混匀后在紫外-可见光分光光度计下测量吸收光谱。

SDM的定量检测：将100 μmol/L适体链溶液稀释至10 μmol/L，取300 μL纳米金溶液于PE管中，再加入25 μL 10 μmol/L适体链溶液混合均匀后，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、5 μg/mL 的SDM，混合5 min。最后向溶液中加入10 μL 2 mol/L NaCl溶液，定容至500 μL。混匀后分别用紫外-可见光分光光度计扫描光谱，用手机捕获图片，用App程序分析补色波长值。

2 结果与讨论

2.1 检测原理

图1 纳米金颗粒的TEM图Fig.1 TEM image of nano-gold

图 2 基于适体-纳米金结构的SDM检测原理图(A)及智能手机检测SDM的手机界面(B)Fig.2 Schematic illustration of SDM detection method based on aptamer-AuNPs structure(A)and App interface of SDM detection smartphone(B)

纳米金颗粒表面带有柠檬酸根负离子，当溶液中存在阳离子时，由于电荷平衡原理导致纳米金聚集，溶液的颜色由红色变成蓝紫色[13，15]。据此，本文提出了基于纳米金-适体链结构的智能手机比色法检测SDM，图1为制备的纳米金颗粒的TEM扫描图，获得纳米金颗粒的直径约10 nm。实验原理如图2A所示，适体链可通过静电作用吸附在纳米金颗粒的表面，当溶液中不存在SDM时，在加入NaCl溶液的情况下，包裹了适体链的纳米金结构避免了范德华力的作用，使得纳米金颗粒无法聚集，因此溶液保持原来的红色。当存在SDM时，SDM特异性地与适体链结合，导致适体链从纳米金颗粒的表面脱离，此时柠檬酸根离子裸露在溶液中，当加入NaCl溶液时，导致纳米金颗粒发生聚集，溶液由红色变成蓝紫色。用App程序捕获待测溶液的图片，根据R、G、B值与CIE色度空间的转换对图片补色波长进行分析[16]，根据补色波长的大小定量检测SDM的浓度。智能手机检测SDM的App界面如图2B，点击Start进入Capture界面对待测溶液进行拍照，然后点击Analyse对捕获图片进行补色波长分析，Result界面直接给出相应的补色波长和SDM浓度值，从而实现对SDM的定量检测。

2.2 实验条件的优化

2.2.1NaCl溶液浓度的优化由于纳米金颗粒在NaCl溶液中会发生聚集，NaCl浓度对纳米金颗粒的聚集会产生很大的影响，因此按照“1.3”实验步骤优化了NaCl溶液的浓度。结果表明，随着NaCl浓度的逐渐增加，纳米金溶液的紫外-可见光吸收光谱在最大吸收峰522 nm处的吸光度逐渐下降，表明纳米金颗粒发生聚集的程度不断增加。当NaCl浓度增至0.04 mol/L时，522 nm处的吸光度达到稳定，最大吸收峰的峰位发生移动。说明此时纳米金颗粒完全聚集，因此实验选择NaCl溶液的最佳浓度为0.04 mol/L。

2.2.2适体链浓度的优化纳米金颗粒表面吸附适体链的浓度会直接影响检测的灵敏度与检测范围，适体链浓度太低，会导致纳米金颗粒过量，此时加入盐溶液，则未与适体链结合的纳米金会发生聚集，导致背景信号增大，灵敏度较低；当适体链浓度过高时，适体链过量，此时SDM会先与过量的适体链结合，而不与吸附在纳米金表面的适体链结合，使得加入盐溶液后，纳米金颗粒不产生聚集。因此实验对适体链浓度进行了优化。结果表明，溶液中不存在适体链时，加入NaCl溶液，纳米金颗粒聚集，纳米金溶液在522 nm处的吸光度最小，随着适体链溶液浓度的增加，纳米金颗粒聚集的程度逐渐减弱，最大吸收峰处的吸光度上升。当加入0.5 μmol/L适体链溶液后，吸光度稳定，说明此时纳米金颗粒与适体链充分结合，NaCl溶液不能导致纳米金聚集，因此选择最佳适体链溶液浓度为0.5 μmol/L。

图3 手机采集的数字图片(A)、溶液的吸收光谱(B)以及图片补色波长与SDM浓度的关系(C)Fig.3 Digital image of analyte solution(A)，UV absorption spectra of AuNPs solution(B)，relationship between comple-mentary wavelength and SDM concentrations(C)

2.3 基于智能手机的SDM补色波长分析

以华为麦芒4智能手机为图片采集工具对SDM进行检测。由于使用智能手机对溶液进行图片采集，避免环境光对实验的影响尤其重要，因此本实验在暗室中采用面光源垂直照射样品，固定智能手机的拍照位置，对每个样品进行图片的采集与分析。手机采集的数字图片(图3A)显示，随着SDM浓度的增大，待测溶液颜色逐渐向蓝紫色变化，表明纳米金的聚集程度逐渐增强；而溶液的最大吸收峰位逐渐发生红移，表明溶液的色调随SDM浓度的增加而发生变化。由SDM浓度与图片补色波长之间的关系(图3C)可知，随着SDM浓度的增加，图片补色波长逐渐增大，直至SDM质量浓度为5 μg/mL时达到稳定，因此检测范围为0～5 μg/mL。根据3σ原则，计算得SDM的检出限为0.13 μg/mL。与传统的检测SDM方法[3-7]相比，该方法克服了对大型仪器的依赖，借助于智能手机图片分析，方法更简单，更利于推广。

3 结 论

本文通过制备纳米金颗粒与适体结合的特殊结构形式，利用智能手机数字化比色分析法实现了SDM的定量检测。对盐浓度以及适体链浓度进行了优化，在最佳实验条件下，通过手机拍照捕获图片，用App对图片补色波长分析，实现了SDM的定量检测，其检测范围为0～5 μg/mL，检出限为0.13 μg/mL。本方法摆脱了传统大型仪器的繁琐检测过程，通过利用智能手机实现了SDM的定量检测。为了方便用户，后续将进一步对检测装置进行研究，以实现一体化和便携式的检测。